第二十一章 毛细管电泳法

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1、第二十一章 毛细管电泳法电泳（electrophoresis）是电解质中带电粒子在电场力作用下，以不同的速度向电 荷相反方向迁移的现象。利用这种现象对化 学和生物化学组分进行分离分析的方法，称 之为电泳法。 1发展历史：电泳技术从发明到现在已有百年历史。Tiselius（提塞留斯）等使用电泳法从牛血清中分 离出血清蛋白、-、-和-球蛋白，获1948年诺贝尔化学奖。80年代初，细径（75m）毛细管被用于电泳， 由此产生了一种新型的分析技术毛细管电泳。2毛细管电泳：毛细管电泳(CE)又称高效毛细管电泳 (HPCE)，是指离子或带电粒子以毛细管为分离室, 以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间

2、 淌度上的差异而实现分离的液相分离分析技术。由 于毛细管内径小，表面积和体积的比值大，易于散 热，因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生，这是 CE和传统电泳技术的根本区别。传统电泳：受到焦耳热的限制，只能在低电场强 度下进行电泳操作，分离时间长，效率低。传统电泳与毛细管电泳的区别：3电泳与液相色谱的异同：同：均为液相分离分析方法。可用相同的理论来描述（差速迁移），一些色谱名词概 念，如：塔板理论、速率理论、保留值等仍可使用。异：分离原理不同；仪器构造有很大的差异。HPLC示意图CE示意图41、毛细管电泳柱效更高，塔板数可达105106/m， （又称高效毛细管电泳，HPCE）；2、分离速度更快；3

3、、溶剂、试样消耗极少，（纳升级）；4、仪器成本低，（不需要高压泵）；5、选择性高。通过选择操作模式和缓冲溶液的成 分以达到对性质不同的成分的有效分离。6、应用广泛。特别适用于氨基酸、多肽、蛋白质 和核酸等生命科学领域的测定，以后逐渐被广泛应用 于生物，化学，医药，环保等领域。与HPLC互相补充 ，共同成为分析化学中重要的分离分析技术。 第一节 毛细管电泳的特点和分类一、毛细管电泳的特点5二、毛细管电泳的分类按毛细管中填充物的性质分类：自由溶液 毛细管内填充物为pH缓冲的电解质溶 液。如：毛细管区带电泳（CZE）。非自由溶液 毛细管内填充物为凝胶或其他筛分 介质。如：毛细管凝胶电泳（CGE）。按

4、分理机制分类：电泳型: CZE、CGE、NACE（非水）色谱型: 胶束电动毛细管色谱（MECC）微乳液电动毛细管色谱（MEECC）电泳/色谱型:毛细管电色谱（CEC）6第二节 毛细管电泳理论一、电泳和电泳淌度（mobility）电泳速度（uep cm/s）： 在单位时间内，带电粒子在毛细管 中定向移动的距离。电泳淌度（ep cm2/(V.s) ）：带电粒子在毛细管中，单位电场强度下、单位时间内定向移动的距离。 电泳：在电场作用下，带电粒子在缓冲溶液中的定向移动。或：单位电场强度下的电泳速度。E：电场强度；L：毛细管长度；V：毛细管两端施加电压7:粒子的Zeta电势；与粒子表面的电荷密度有关，近

5、似 正比于Z/M2/3 ；:介质的粘度。:介质的介电常数；电泳淌度8有效淌度eff 、有效电泳速度ueff ：考虑实际溶液中，溶质分子的离解程度，离子的活度 系数对离子淌度的影响。溶质分子的 i 级离解度；综上所述：荷电粒子在电场中的迁移速度，除与电场强度和介质 特性有关外，还与粒子离解度、电荷数以及粒子的大小和 形状有关。离子的活度系数。9在熔融石英毛细管内壁覆盖着一层硅氧基（SiO）阴离 子，能够吸引溶液中的阳离子，由此在毛细管内壁形成双电层 。在电场作用下，双电层外缘扩散层中富集的阳离子被负极吸 引导致溶液向负极流动（因为离子是溶剂化的），这种效应称 为电渗。产生的溶液流动称为电渗流（e

6、lectroosmotic flow， EOF） 。 电渗流形状：平头塞状SiO二、电渗和电渗率（电渗淌度）电渗（electroosmosis ）：一种液体相对于带电的管壁移动的现象。10在电场中，液体相对毛细管内壁的移动均为向负 极方向的移动，电渗速度是电泳速度的57倍，因此 无论是正离子、负离子还是中性分子，都将随着电渗 流朝着一个方向移动。电泳荷电粒子电渗溶液（缓冲溶液，pH2）电渗与电泳作用的对象不同:当荷电粒子的移动方向（电泳方向）与电渗方向 一致时，会加快粒子的泳动速度，反之，当荷电粒子 的移动方向与电渗方向相反时，会减慢粒子的泳动速 度。11电渗速度： 电渗率： os 一般情况下

7、，电渗流是从正极流向负极，其速度大小 与电场强度、Zeta电势、双电层厚度、介电常数和介质的 粘度有关。电渗速度是电泳速度的57倍。12三、表观淌度和权均淌度在CE中，同时存在着电泳流和电渗流，在不考虑相 互作用的前提下，粒子在毛细管内的运动速度应当是两种 速度的矢量和。表观迁移速度（uap cm/s） 表观淌度（apparent mobility） （ap ）组分表观淌度表观迁移速度 正离子 中性离子 负负离子表20-1 电泳中的组分迁移速度13如此：当试样组分在电迁移过程中，将发生相间 分配，其迁移速度或淌度必然会发生变化。如何变化呢？由表中可看出：中性分子在毛细管电泳中不能 被分离。为了

8、能够使中性分子也能够被分离，根据色谱 原理，引入了另一相（P相）。如： 准固定相（可迁移，方向可正，可 负）P相色谱固定相高分子团胶束14电泳色谱P相加入之后：中性分子不受电场影响，其分离机理应当是色谱 机理。荷电粒子存在双重机理究竟哪一重机理起主要作用，就要看其所占权重。p: P相中的表观淌度。kp容量因子，np、ns分别为组分 在P相和溶剂相中的分子数增加了分析的范围，增加了分析方法的选择性。: 权均淌度。u:权均速度15四、分离效率和谱带展宽（一）理论塔板数和塔板高度n、H：分别为塔板数和塔板高度；tm ：流出曲线最高点所对应的时间；Ld：进样口到检测器之间的距离。虽然电泳与色谱分析原理

9、上有很大区别，但仍然 可将色谱分析中的分离效能表征方法用于电泳。16（二）谱带展宽影响谱带展宽的原因有两类： 毛细管柱内的溶液和溶质。包括：自热、扩散和吸附。 仪器系统。包括：进样系统和检测系统。1. 电渗流型HPCE（a）和HPLC（b） 柱中溶液流型的比较ab高压低压17电渗流型的特点：扁平型的塞子流。是毛细管电泳高柱效的重要原因。毛细管电泳的速率方程：毛细管电泳无固定相，所以不存在涡流扩散相和传质阻 抗相，只有纵向扩散相。D：组分的扩散系数理论塔板数与电场强度成正比。E 越高越好？182. 自热电流通过缓冲溶液时将会产生焦耳热（或称自热）。与施加的电场强度有关；与毛细管内径有关；内径越小

10、，自热就越小，（常用25 75m）。与介质的浓度有关。自热过大将会破坏扁平型塞子流，使柱效降低。自热与哪些因素有关呢？自热造成的柱效降 低较小c：介质的浓度当19自热是如何影响柱效的呢？自热如何产生的呢？ 由于焦耳热通过管壁向环境散热，因此在毛细管内 形成径向温度梯度。温度径向梯度将会导致缓冲溶液的径向粘度梯度， 从而产生离子迁移速度的径向不均匀分布，破坏了扁平 型塞子流的形状。毛细管横切面示意图内腔弹性熔融石英聚酰亚胺层聚酰亚胺层的作用：增加弹性，不易折断。20为了降低温度差，可采取以下措施： 减小毛细管内径，常用25 75m。不能太小，否则 会对进样和检测带来困难，并且易造成柱堵塞。 增加

11、壁厚（375m）。 降低聚酰亚胺涂层的厚度。 降低缓冲溶液的浓度。 采用冷却系统。21内半径（m）壁温度（K）温差（K）25299.00.53 50301.21.39 75304.23.14 100307.75.58 125311.68.72不同内径毛细管的管壁温度及其轴心与管壁的温差223. 扩散与吸附纵向扩散：标准偏差D：溶质的扩散系数（随分子量的增加而降低）tm：迁移时间。影响迁移时间的 因素（参数）毛细管长度 外加电压 缓冲溶液的种类 等扩散23吸附熔融石英内壁表面对溶质分子的吸附作用。解决办法：内壁涂层（或键合）如：聚乙烯亚胺（PEI）涂层甲基硅烷化键合：SiOHSiOSiC或SiC

12、24五、分离度两相邻组份的相对 速度差25第三节 毛细管电泳的主要分离模式一、毛细管区带电泳（CZE）毛细管自由溶液区带电泳应用实例1：26应用实例2：27蛋白质肽片段混合物酶切CZE分离特征性肽图微量制备CE分别测定各片段的氨基酸序列整个蛋白质 的一级结构蛋白质分析：28二、胶束电动毛细管色谱（MEKC） 溶质缓冲溶液胶束（假固定相）29三、毛细管凝胶电泳（CGE） 综合了CE和平板凝胶电泳的优点，是当今分离度 极高的一种电泳分离技术，特别适用于蛋白质、多肽、 寡核苷酸、DNA等的分离分析，特别是与激光诱导荧光 （LIF）检测技术结合，成为DNA快速序列分析的优选 方案，在人类基因工程计划中

13、发挥重要作用。两种机理：电泳分子尺寸聚丙烯酰胺凝胶（PAG）（交联和非交联） 凝胶种类琼脂糖、甲基纤维素及其衍生物葡聚糖、聚乙二醇等原则上是按照分子大小分离30四、毛细管电色谱（CEC） 两种机理：电泳色谱根据组分在流动相和固定相 中分配系数的不同和自身电 泳淌度的差异进行分离。五、非水毛细管电泳（NACE） 解决了一个问题：样品溶解问题；条件：有机溶剂中须加入电解质，选择上比较困难；比水溶液体系可承受更高的操作电压产生的高电场， 因而会有更高的分离效率。31第四节 毛细管电泳仪基本结构：高压电源、进样、填灌/清洗、毛细管温控、检测、记录/数据处理毛细管电泳仪示意图32一、高压电源包括：电源、

14、电极、电极槽 030kV,精度1%电极，铂丝（0.51mm）电极槽高压危险！保护！33二、毛细管柱1.材料玻璃：早期使用，现已淘汰。电渗太强，对紫外光有吸收，并且杂质较多。机械强度低，易折断。聚四氟乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯和聚丙烯：机械和化学性能稳定，对近紫外光和可见光透明，电渗较低。缺点：样品吸附较强，热传导差，管内径不易均匀。34石英：金属杂质少。能够透过短紫外光，拨去一小段（约1cm）聚酰亚胺 层后，即可作为光学检测器窗口。机械强度高，不易折断。表面存在硅醇基，产生氢键吸附，并产生电渗流。2.内径和长度CE实现高电场的关键部件是小孔径毛细管柱。在相 同的电压下，孔径越小，电流就越小，产生的

15、焦耳热量就 越少。另外，孔径越小，散热效果也越好，柱效提高。35那么，是否孔径越小越好呢？虽然已有用2m的报道，但是孔径小，样品负载小， 检测困难，也增加了进样、清洗等操作上的困难。常用25 75m，最常用的是50m和75m。柱的外径一般是大一些好，外径越大，散热面积大， 散热速度快。常用外径 300m。363.未涂渍柱首次使用前的预处理1mol/L NaOH水运行缓冲液515倍柱体积515倍柱体积35倍柱体积依次冲洗柱长选择：虽然增加柱长可以增加理论塔板数（电场强度须保 持恒定），但是柱长增加将会降低电场强度的稳定性， 解决办法是增加操作电压。操作电压焦耳热所以，70cm为阈值，常用30cm

16、左右（区带电泳）。但是 :37三、进样1. 电动进样当把毛细管的进样端插入试样溶液中并加上电场E 时 ，组分会因电迁移或电渗作用而进入管内。优点：对毛细管的填充介质没有特别限制；可实现自动化进样。缺点：对离子组分存在进样偏向。uap大者，进多；小 者进少或不进。如此，降低了分析的准确性、可靠性和重 现性。382. 压力进样（流动进样）当将毛细管的两端置于不同的压力环境时，管中溶液 既能流动，将样品带入。优点：没有组分偏向问题，进样量与试样基质无关。缺点：选择性差，组分与基质都同时被引进管中，对 后续的分离产生影响（增加难度）。条件：毛细管填充物必须具有流动性。393. 扩散进样利用浓度差扩散原理将试样分子引入毛细管。优点：对管内介质没有任何