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1、酒制对大黄中游离蒽醌在大鼠体内组织分布的影响酒制对大黄中游离蒽醌在大鼠体内组织分布的影响摘要 传统炮制理论指导思想“酒制升提”，大黄经过炮制成为饮片酒大黄治疗 上焦病症，如目赤肿痛，口舌生疮等疾病，炮制前后大黄药性的改变使得其临床应用侧重 点不同，为研究中药炮制理论的科学内涵，该文同时建立测定大鼠组织中芦荟大黄素、大 黄酸和大黄素的液-质联用方法，通过分别灌胃给予 SD 大鼠大黄生品和酒制品水煎液，采 用 LC-MS 测定组织（心、肺、脑、肝、肾）中芦荟大黄素、大黄酸和大黄素的含量，探 讨酒制对大黄中游离蒽醌成分在大鼠体内组织分布的影响。试验结果显示大黄酒制能明显 改变芦荟大黄素、大黄酸和大黄
2、素在大鼠体内的分布，其中各成分在心与肺组织中的分布 增加，在肝和肾中的分布与生品组相比变化不大，而在脑中没有检测到 3 种成分，提示芦 荟大黄素、大黄酸、大黄素不能透过血脑屏障。酒制对大黄中游离蒽醌成分在大鼠体内的 药物组织分布有较大影响，这也验证了传统中医理论，酒大黄多用于治疗上焦病症，该研 究结果为探讨大黄炮制机制提供了实验依据。 关键词 芦荟大黄素；大黄酸；大黄素；组织分布；液-质联用 Effects of wine processed Rheum palmatum on tissue distribution of aloe-emodin， rhein and emodin in ra
3、ts WU Yu1，PENG Xiao-qing2， JIANG Xiao-yan1， SHI Mei-qin1， YANG Shui- ying1， FU Ying-jun1， PENG Min1， CAI Yan1， JIANG Sheng-shi1 ， XU Yan1 * （1. Department of Pharmacy， Nantong Chinese Medicine Hospital， Nantong 226001， China； 2. Medical School of Nantong University， Nantong 226001， China） Abstract U
4、nder the traditional processing theory “wine processing could promote the efficacy”， Rhubarb after wine processing could treat the upper energizer diseases such as red swelling， and breath sores. Processing changes the medicinal properties of rhubarb， and thus results in different focuses in clinica
5、l application. In this study， a sensitive and specific method was developed for the determination of aloe-emodin， rhein and emodin in rats tissue. Rhubarb raw materials and its wine processed decoction were given to SD rats respectively by gavage administration， and then the contents of aloe-emodin，
6、 rhein and emodin in the tissues （heart， lung， brain， liver， kidney） were determined by HPLC-MS to explore the effect of wine processing on free anthraquinones in rat tissues. Experimental results showed that wine processing can significantly change the distribution of aloe emodin， rhein and emodin
7、in rats in vivo， and the distribution of these components was increased in heart and lung tissues.There was no significant change of distribution in the liver and the kidney as compared with raw product group， and these three ingredients were not detected in the brain， indicating that aloe-emodin， r
8、hein， emodin can not pass through the blood brain barrier.Therefore， wine processing had greater effect on distribution of free anthraquinones in rat tissues.This also verified the theory of traditional Chinese medicine， providing experimental basis for rhubarb processing mechanism. Key words aloe-e
9、modin； emodin； rhein； tissue distribution； HPLC-MS 大S 始载于神农本草经 ，为我国临床应用最为广泛的中药材之一，是传统泻下类中药的代表，来源于蓼科植物掌叶大黄 Rheum palmatum L.、唐古特大黄 R. tanguticum Maxim. ex Balf.或药用大黄 R. officinale Baill.的干燥根及根茎，具有泻下攻积、清热泻火、 凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄之功效1，大黄具多类药效活性成分，其中以蒽醌类、二蒽酮类、类鞣质和多糖研究最多；其药理作用主要有调节胃肠功能、抗病原微生物、抗肿瘤、保护心脑血管、抗炎保肝、抗衰
10、老、抗菌抗病毒、降压降脂、抗肿瘤等作用2-7。 中药饮片入药是中医药临床用药的一大特色，也是区别中药和天然药物的显著标志。中药 炮制基本原理的核心是中药饮片炮制后其药性发生了改变，而根源还是炮制后其内在物质 基础内涵发生了改变。2015 年版中国药典中记载了大黄生品、酒大黄、熟大黄和大黄 炭8。大黄酒制后，引药上行，临床广泛用来治疗上焦病症，如目赤肿痛，口舌生疮等， 疗效显著。现代研究表明，酒制能显著影响大黄中主要活性成分含量，游离蒽醌含量增加， 结合蒽醌类衍生物含量下降9-10，从而降低大黄生品泻下效力。另有研究表明，大黄酒制 后对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌的抑制作用较大黄生品好11
11、。 近年来，大黄药材或复方中蒽醌类成分体内的药动学及组织分布研究多有报道12- 14。然而，酒制对大黄中有效成分在大鼠体内组织分布影响的研究尚未见报道。本文采用 液相色谱-质谱联用的方法，比较大黄生品和酒制品灌胃给药后大黄酸、芦荟大黄素和大黄 素在大鼠体内的组织分布状况，进一步揭示大黄酒制的炮制机制，为临床用药提供参考。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 LC-MS 2020 高效液相色谱-质谱联用仪（日本岛津公司） ，包括 SPD-M20A 二极管 阵列检测器，质谱为 LC-MS-2020 单极四级杆，电喷雾离子源（ESI） ；QF-3800 氮气吹干 仪；AG285 电子天平（瑞士 Me
12、ttler Toledo 公司） ；KQ-2200B 型超声波清洗器（昆山市超 声仪器有限公司） ；弗鲁克 F6/10 型组织匀浆机（上海达平仪器有限公司） ；TGL-16B 台式 离心机（上海安亭科学仪器厂） ；XW-80A 微型漩涡混合仪（上海沪西分析仪器厂） 。 甲醇（色谱纯，美国 Tedia 公司） ；乙酸乙酯、乙酸（分析纯，上海凌峰化学试剂有 限公司） ；乙酸铵、乙酸钠、维生素 C、盐酸（分析纯，南京化学试剂有限公司） 。大黄 Radix et Rhizoma Rhei 购自于安徽省亳州市药材总公司，经南京中医药大学药学院中药鉴 定教研室刘训红教授鉴定为蓼科植物掌叶大黄的干燥根及根茎
13、。酒大黄按照 2010 年版中 国药典一部规定的炮制方法制得。芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、1，8-二羟基蒽醌对照 品（纯度98%）均购自于中国食品药品检定研究院。SD 大鼠，雄性，体重 200230 g， 由上海斯莱克动物实验中心提供。 1.2 色谱质谱分析条件和数据处理 1.2.1 色谱条件 Kromsail C18 色谱柱（4.6 mm150 mm，5 m） ；流动相甲醇-3 mmol L-1 乙酸铵（7525）等度洗脱，流速 1 mL min-1；柱温 40 ；检测波长为 254 nm。 1.2.2 质谱条件 采用负离子选择性检测（SIM）模式，选择的检测离子质荷比为268.8（大黄素、
14、芦荟大黄素） ，282.8（大S 酸） ，239.9（内标，1-8 二羟基蒽醌） 。其他工作参数设置为：电喷雾电离（ESI） ；探针温度 350 ；曲形脱溶剂装置（CDL）温度280 ；加热模块温度 320 ；探针电压 4.5 kV；检测器电压 1.5 kV；CDL 电压 50 V；Q- array 电压为 DC 50 V，RF 120 V；干燥气流速 5 L min-1；雾化气流速 1.5 L min-1。 实验获得的数据采用中国药理学会数学药理专业委员会编制的药代动力学参数计算软件 3P97 处理。 1.3 生大黄及酒大黄供试品溶液制备 大黄生药 54 g，600 mL 纯净水冷浸 30
15、min，煎煮 45 min，过滤；药渣加入 300 mL 纯净水，煎煮 20 min，合并滤液，浓缩至 300 mL，4 保存。酒大黄供试液制备同生品。 1.4 组织分布研究 雄性 SD 大鼠 60 只，随机分为 2 组，其中 1 组为生品组，1 组为酒制组，每组 30 只， 实验前 12 h 禁食不禁水。按照大黄提取物 10.0 mL kg-1 的灌胃剂量给药，于给药后 5，15，30，60，120，240 min（每个时间点 10 只大鼠，每组各 5 只）断头处死大鼠，立 即解剖采集心、肺、脑、肝、肾样品。当即用 0.9%冰生理盐水冲净表面血液及内容物后， 用滤纸吸干，称重，加入 2 倍量
16、冰生理盐水匀浆，得到匀浆液，-20 冷冻保存，备用。 1.4.1 样品处理 精密吸取大鼠血浆或组织匀浆液 100 L，加入内标 10 L（161 mg L-1） ，再加入 50 L pH 为 5 的醋酸盐缓冲剂和 50 L 维生素 C （100 g L-1） ，涡旋 30 s，加 50 L 0.1%HCl 溶液，及 0.8 mL 乙酸乙酯，涡旋 3 min，4 000 r min-1 离心 5 min，分离乙酸乙酯层，吹干，用 100 L 乙腈复溶，取上清液，12 000 r min-1 离心 3 min，取 20 L 进样，LC-MS 测定。 1.4.2 标准溶液配制 精密称取芦荟大黄素、大黄酸和大黄素对照品适量，用甲醇配 制成混合标准溶液（芦荟大黄素 14.5 mg L-1，大黄酸 120 mg L-1，大黄素 10 mg L-1） 。另精密称取内标（1，8 二羟基蒽醌）适量，用甲醇配制成质
