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1、华中农业大学动物科技学院实验一 哺乳动物白细胞分离 左 波、柴 进了解哺乳动物白细胞分离原理掌握兔及猪白细胞分离方法明确畜禽血液细胞组成差异一、实验目的二、实验原理真核基因组DNA存在于细胞核的染色质中血液 新鲜组织 福尔马林浸泡标本 石蜡标本 冰冻组织 毛发 体腔液 洗嗽液 精液1 常用于DNA提取的材料：血液 血 浆（50-60%） 晶体物质 2-3% 水份 90-92% 血浆蛋白 5-8% 血细胞（40-50%） 红细胞 白细胞 血小板 2 血液组成 红细胞 又称红血球或红血细胞，是血液中最 多的一种血细胞。红细胞中含有血红 蛋白，因而使血液呈红色。人和哺乳动物的成熟红细胞无细胞核白细胞
2、 白细胞无色呈球形，有细胞核，体积比红细胞大光镜下，根据白细胞胞质有无 特殊颗粒，可将其分为有粒白 细胞和无粒白细胞。有粒白细 胞又根据颗粒的嗜色性，分为 中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和 嗜碱性粒细胞。无粒白细胞有 单核细胞和淋巴细胞两种白 细 胞有粒嗜酸性粒细胞中性粒细胞嗜碱性粒细胞无粒单核细胞淋巴细胞血小板 也称血栓细胞，是体内最小的血细胞，是由骨 髓中成熟的巨核细胞裂解、胞质脱落而成，呈 圆形、椭圆或不规则的形状，无细胞核。但它并非只是细胞碎片，它有一定的结构，能 进行新陈代谢。血小板的功能主要是促进止血和加速凝血 血小板遇到粗糙的 血管壁伤口，就被 破坏并释放出促使 血液凝固的凝血酶 。这
3、种酶的前身是 凝血酶原，在Ca2+参与下，凝血酶原 激活物可催化凝血 酶原转化为具有活 性的凝血酶。在凝血酶、Ca2+和 其它一些因子的作 用下，经过一系列 变化，可溶性的纤 维蛋白原就变成了 不溶性的丝状纤维 蛋白。这种蛋白形 成后，互相交织成 网，并把血细胞网 罗在内，使原来的 血液凝集成块。3 抗凝可通过以下几种途径来实现： （1）往血液中加入适量的抗凝剂（如柠檬酸钠） 将Ca2+夺去，使其成为失钙血，这样可以防 止纤维蛋白原变成纤维蛋白，从而避免了血 液凝固。（2）用试管刷反复搅拌，取出血液中的纤维蛋白， 这种血叫去纤维蛋白血。由于缺少了凝血必需 物质（纤维蛋白），所以血液不再凝固。（
4、3）降低血液温度，使酶的活性降低。（4）保护血小板，减少凝血酶的释放。 抗凝剂（1）乙二胺四乙酸（EDTA）盐，EDTA有二钠、 二钾和三钾盐。均可与钙离子形成螯合物，从 而阻止血液凝固。 Na2C10H14O8N2+ Ca2+CaC10H12O8N2+2Na+2H+适用于全血细胞分析及血细胞比容测定。（2）柠檬酸钠（trisodium citrate），柠檬酸盐可与血 中钙离子形成可溶性螯合物，从而阻止血液凝固2Na3C6H5O7+2Ca2+2CaC6H5O7+6Na+适用于红细胞沉降率和凝血功能测定。 （3）草酸钠（sodium oxalate），草酸盐可与血中钙离子生成草酸钙沉淀，从而阻
5、止血液凝固。 适用于一般普通生化检查（4）肝素（heparin），肝素的阴离子活性基团与抗 凝血酶III（AT-III）的阳离子基团结合，加速 抗凝血酶-凝血酶复合体形成，灭活丝氨酸蛋白 酶，从而阻止凝血酶形成，拮抗凝血酶和阻止 血小板聚集。此外肝素还有催化抑制凝血因子 的作用。适用于血流变检查从血管取少量血液加 入适量抗凝剂,有形成 分经自然沉降或离心 沉淀后，血液可分出 三层：上层为淡黄色 的血浆，下层为红细 胞，中间的薄层为白 细胞和血小板 4 白细胞分离5 细胞破碎方法技术原理效果成本举例化 学 法渗透冲击渗透压破坏细胞温和便宜溶血酶消化法细胞壁被消化， 使细胞破碎温和昂贵增溶法表面活
6、性剂溶解 细胞壁温和适中胆盐作用于 大肠杆菌 脂溶法有机溶剂溶解细 胞壁并使之失稳适中便宜甲苯破碎酵 母细胞 碱处理法碱的皂化作用使 细胞壁融解剧烈便宜方法技术原理效果成本举例 机 械 法匀浆法（ 片型）细胞被搅拌器劈碎 适中适中动物组织及动 物细胞 研磨法细胞被研磨物磨碎 适中便宜 超声波法用超声波的空穴作 用使细胞破碎适中昂贵细胞悬浮液小 规模处理匀浆法（ 孔型）须使细胞通过的小 孔，使细胞受到剪 切力而破碎剧烈适中细胞悬浮液大 规模处理珠磨破碎 法细胞被玻璃珠或铁 珠捣碎剧烈便宜细胞悬浮液和 植物细胞的大 规模处理渗透冲击法（Osmotic Shock）此法将一定体积的细胞液加到2倍体积
7、的水中，细胞中溶质浓度高，水不断进入细胞，使细胞膨胀，最后导致破裂。在血浆中无机盐形成的渗透压称为晶体渗透压 由血浆蛋白形成的渗透压称为胶体渗透压 血浆渗透压的总值为两者之和。红细胞在此溶液中大小、形状不变，故称为 生理盐水原理0.9%氯化钠溶液的渗透压与血浆渗透压相等血液中去除血细胞后余下部分就是血浆。 将正常红细胞悬浮于不同浓度的NaCl溶液中即可 看到：在等渗溶液中的红细胞保持正常大小和双凹 圆碟形；在渗透压递减的一系列溶液中，红细胞逐 步胀大并双侧凸起，当体积增加30%时成为球形； 体积增加45%60%则细胞膜损伤而发生溶血。红细胞在低渗溶液中会胀大，破裂，发生溶血， 故低渗溶液不能用
8、作静脉输液。 高于或低于血浆渗透压的则相应地称为高渗或低 渗溶液。细胞破碎的难易决定于其类型，红血球细胞容 易溶破，动物组织细胞只有当其组织被机械切 碎或匀浆后才易溶破。植物细胞很难溶破，因 为植物细胞中含有大量的木质成分。三、主要仪器及试材实验器材：一次性注射器，长针头，10ml离心管，记号笔，酒精棉球，离心机， 一次性手套等试 剂：蒸馏水，抗凝剂（0.5M EDTA溶 液、或肝素）等。四、实验方法与步骤采血5ml左右，EDTA抗凝 3000rpm离心15min，弃上层血浆 加入2倍体积双蒸水，摇匀沉淀，静置10-15min，破碎红细胞 3000rpm离心15min，轻轻弃去上层，留白细胞沉淀 （视红细胞破碎程度，决定是否重复此步骤1次） 五、实验注意事项（2）采血后，应立即（或提前）加入1/10血样体 积的0.5M EDTA抗凝剂，充分混匀，低温 保存或立即送实验室分离白细胞；（1）防止污染血液及被血液所带的病菌等感染（3）分离白细胞时，离心速度不宜过大。六、实验结果处理提交“哺乳动物白细胞分离”实验报告（统一格式纸张）实验目的实验原理实验器材实验方法与步骤实验结果与分析思考题七、思考题（1）畜禽血液有核细胞构成的差别；（2）EDTA抗凝机制；（3）渗透冲击法破碎细胞原理。
