多肽与蛋白质类药物

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1、多肽与蛋白质类药物多肽与蛋白质类药物l 一.多肽与蛋白质类药物概述l 二.多肽与蛋白质类药物的主要生产方法l 三.重要的多肽与蛋白质类药物的制备一.多肽与蛋白质类药物概述l(一) 多肽类药物l 由氨基酸缩合而成的化合物称为多肽，它们是通过一个氨基酸分子的-NH与另一分子氨基酸的-COOH脱去一分子水形成-CO-NH-键而相互连接起来的。一.多肽与蛋白质类药物概述l一般将50或50个以下的氨基酸残基组成的化合物，列入多肽。多数无特定空间构象，某些多肽也有一定构象，但其构象的坚固性远不如蛋白质，其构象的浮动性很大。l多肽在生物体内的浓度很低，在血液中一般为 ,但它们的生理活性很强，在调节生理功能时

2、起着非常重要的作用。一.多肽与蛋白质类药物概述l活性多肽主要是从内分泌腺、组织器官、分泌细胞和体液 中产生或获得的。l1953年人工合成了第一个有生物活性的多肽催产素（ OT）。l到了60、70年代神经肽的研究进入高潮。同时，由于很多 脑活性肽也存在于胃肠道组织中，从而推动了胃肠道激素 的研究.l到了70年代，生物技术的发展更开拓了多肽药物的新领域 细胞生长调节因子。现已发现的细胞生长调节因子已 近100种.一.多肽与蛋白质类药物概述l许多活性蛋白质，多肽都是由无活性的蛋白质前体，经过酶的加工剪切转化而来的。它们中间许多有共同的来源，相似的结构，甚至还保留着若干彼此所特有的生物活性。l研究活性

3、多肽结构与功能的关系及活性多肽之间结构的异同与其活性的关系 , 将有助于设计和研制新的活性多肽药物。l临床上有一些确有疗效的组织提取制剂其有效成分有的还不十分清楚，从活性肽或细胞生长调节因子的角度去研究它们的物质基础和作用机制，预计可获得成效主要多肽类药物1多肽激素l 垂体多肽激素：促皮质素(ACTH),促黑激素(MSH),催产素(OT)l 下丘脑激素：促甲状腺激素释放激素（TRH），生长素抑制激素（GRIF）l 甲状腺激素：甲状旁腺激素（PTH），降钙素（CT）。l 胰岛激素：胰高血糖素，胰解痉多肽。l胃肠胃道激素：胃泌素，胆囊收缩素一促胰激素（CCK-PZ）,缓激肽l 胸腺激素：胸腺素、胸

4、腺肽, 胸腺血清因子主要多肽类药物l2多肽类细胞生长调节因子表皮生长因子（EGF）、转移因子（TF）、心钠素（ANP）等。l3含有多肽成分的其他生化药物骨宁,血活素,氨肽素,蜂毒,蛇毒,胎盘提取物,脾水解物,心脏激素等.一.多肽与蛋白质类药物概述-蛋白类药物l（一）蛋白类药物的分类l（二）蛋白类药物作用方式l（三）应用基因工程技术制备重要的蛋白类药物l（四）蛋白质工程技术的应用（一）蛋白类药物的分类l1蛋白质激素（1）垂体蛋白质激素 生长素,催乳激素,促甲状腺激素等（2）促性腺激素 人绒毛膜促性腺激素,血清性促性腺激素等（3）胰岛素及其他蛋白质激素 胰岛素,松弛素等 l2血浆蛋白质 白蛋白，免

5、疫丙种球蛋白,纤维蛋白原,抗凝血因子等。l3蛋白质类细胞生长调节因子干扰素, ，白细胞介素,肿瘤坏死因子等返回目录（一）蛋白类药物的分类l4黏蛋白 胃膜素,硫酸糖肽,内在因子等。l5胶原蛋白 明胶，阿胶,冻干猪皮等。明胶：牛、羊的皮、骨、肌腱中所含的骨胶原， 经水煮并蒸发浓缩而得到的干燥蛋白质。治疗吐血、 内脏出血，也用于胶囊、肠衣、栓剂的基质。阿胶：驴皮去毛后加水熬制而成的胶块。滋肾补 血，止血。返回目录（一）蛋白类药物的分类l6碱性蛋白质 硫酸鱼精蛋白，存在于鱼类成熟的精子中，强碱性。l7蛋白酶抑制剂 胰蛋白酶抑制剂，亦称抑肽酶。l8植物凝集素 PHA、ConA。返回目录（二）蛋白类药物作

6、用方式l已从生化药物对机体各系统和细胞生长的调节扩展到被动免疫、替代疗法、抗凝血剂以及蛋白酶的抑制物等多种领域返回目录（三）应用基因工程技术制备重要的 蛋白类药物l已实现产品工业化的有几十种，并正从微生物和动物细胞的表达转向基因动植物的表达。返回目录（四）蛋白质工程技术的应用l鉴于一些蛋白质和多肽生化药物有一定抗原性，容易失活，体内半衰期短，用药途径受限制等缺点。应用蛋白质工程技术对其进行结构修饰，设计小分子代替大分子，并增强或增加其选择性疗效。返回目录二.多肽与蛋白质类药物的制造方法l(一) 蛋白质与多肽类类药物提取,分离纯化l 1.材料选择l原料来源包括动物、植物及微生物等。选择原 料时应

7、考虑来源丰富、目的物含量高、成本低 且易于提取的材料。l同时应考虑其种属、发育阶段、生物状态、来 源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞 等因素的影响。二.多肽与蛋白质类药物的制造方法l 2.提取l 将目的物从复杂的生物体系中转移到特定的人 工液相体系中.提取的总要求是最大限度的把有效 成分提取出来,关键是溶剂的选择.提取所用溶剂的 选择标准,首先对被制备物具有最大的溶解度,并在 提取中尽可能减少一些不必要的成分.常用的手段 是调整溶剂的PH,离子强度,溶剂成分配比和温度 范围等.二.多肽与蛋白质类药物的制造方法l3.分离纯化l 多肽及蛋白质的分离纯化是将提取液中的目的蛋 白质与其他非蛋白质

8、杂质及各种不同蛋白质分离 开来的过程.l 常用的分离纯化方法有:l (1) 根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质l 在等电点时蛋白质性质比较稳定,其物理性质如 导电性,溶解度,黏度,渗透压等皆最小,因此可利用 蛋白质等电点时溶解度最小的性质来制备蛋白质.二.多肽与蛋白质类药物的制造方法l 用等电点沉淀法可以将所需要的蛋白质从 溶液中沉淀出来,还可以将提取液中不需要 的杂蛋白通过改变PH而沉淀除去,一般是将 PH分别调到需提纯物质等电点的两侧.l 用等电点法沉淀蛋白质常需配合盐析操作, 而除去不需要的杂蛋白时,常需配合热变性 操作.l 等电聚焦电泳除了用于分离蛋白质外,也可 用于测定蛋白质的等电点

9、.二.多肽与蛋白质类药物的制造方法l(2)根据蛋白质分子形状和大小不同来纯化 蛋白质l 蛋白质的一个特点是分子大,而且不同种类 的蛋白质分子大小也不相同.可以用凝胶过滤 法,超滤法,离心法及透析法等将蛋白质与其他 小分子物质分离,也可将大小不同的蛋白质分 离.二.多肽与蛋白质类药物的制造方法二.多肽与蛋白质类药物的制造方法l (3) 根据溶解度的不同来纯化蛋白质l 分离方法有蛋白质盐溶与盐析法,结晶法和低 温有机溶剂沉淀法.l 乙醇和丙酮是有机溶剂沉淀法中最常用的有 机溶剂,由于丙酮的介电常数小于乙醇,故丙酮 的沉淀能力比乙醇强. 二.多肽与蛋白质类药物的制造方法l(4). 根据电离性质的不同

10、来纯化蛋白质l对蛋白质的离子交换层析，一般多用离子交换纤维和以葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等为骨架的离子交换剂，主要是取其具有较大的蛋白质吸附容量，较高的流速和分辨率等优点。l另外电泳法亦是利用电离性质的不同来分离纯化蛋白质。 二.多肽与蛋白质类药物的制造方法(5) 根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质l 主要手段是亲和层析法,即利用蛋白质分子 能与其相应的配体进行特异的,非共价键的可 逆性结合而达到纯化的目的.l 一些蛋白质如胰岛素,胰高血糖素,催乳素,生 长素以及酶类都可用专一的抗体作为配基进行 纯化,染料配基亲和层析亦用于IL-2的纯化. 二.多肽与蛋白质类药物的制造方法l(

11、6).根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结合来纯化蛋白质。l 利用蛋白质上的疏水区与吸附剂上的疏水基团结合,在通过降低介质的离子强度和极性,或用去垢剂的溶剂,提高洗脱剂的PH等方法将蛋白质洗脱下来.二.多肽与蛋白质类药物的制造方法l(7).根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白质l 这是一种以化合物在两个不相容的液相之间 进行分配为基础的分离过程,称之为逆流分溶. 利用逆流分溶技术分离垂体激素,氨基酸,DNA 是很有效的.二.多肽与蛋白质类药物的制造方法l(8).根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白 质l 最广泛的吸附剂有结晶磷酸钙,磷酸钙凝胶,硅 胶,皂土沸石,硅藻土,活性炭等.l (9

12、).根据蛋白质的某些特殊性质进行纯化l 如蛋白质的热变性,耐水解酶等二.多肽与蛋白质类药物的制造方法l4.分离纯化方法的选择l (1) 分离纯化早期使用方法的选择l 早期分离纯化用萃取,沉淀,吸附等一些分辨力低 的方法比较有利.l 总的来说,早期分离提纯的方法,选择的原则一 般是从低分辨率到高分辨率,而且负荷量较大为合 适.二.多肽与蛋白质类药物的制造方法l(2) 各种分离纯化方法的使用顺序l 纯化方法顺序先后的安排,应考虑到有利于减少 工序,提高效率.l 对于未知物通过各种方法的交叉分离纯化,还可 以进一步了解制备物的性质,以补充预实验时所获 得的知识片面性.二.多肽与蛋白质类药物的制造方法

13、l(3).分离纯化后期的保护性措施l 后期产品损失主要途径有玻璃器皿的吸附,操作 过程中液体的残留,空气的氧化和某些事先无法了 解的因素. 在探索性实验中为了取得一定量的产 品,提供分析鉴定之用,常常加大原材料的用量,并 在后期纯化工序中注意保持样品溶液较高浓度,以 防止制备物在稀溶液中变性,有时加入一些电解质 以保护生化物质的活性,减少样品溶液在器皿中的 残留量等.二.多肽与蛋白质类药物的制造方法l(4) 对分离纯化每一步骤方法的优劣进行综 合评价l 每个分离纯化步骤方法的好坏,除了从分辨本领 和重现性二方面考虑外,应应注意方法本身回收率 的高低,特别是制备某些含量很低的物质时,回收率 的高

14、低十分重要.一个好的分离纯化方法应该是提 纯倍数和回收率同时都有较大的提高.但必须指出, 整个分离纯化步骤是连续进行的.4.分离纯化方法的选择影响因素l1时间因素在蛋白质分离和纯化过程中，共同的问题是蛋白质反应达到平衡所需要的时间，而且为避免蛋白质的变性 、微生物的污染等，操作常在低温环境中进行。通常在25时，化学反应的速率是低温5时的3-4倍。l2选择离子交换层析条件的程序4.分离纯化方法的选择3.蛋白质分离纯化的可能的技术手段的组合4.分离纯化方法的选择l分步分离纯化的可能步骤二.多肽与蛋白质类药物的制造方法l5.溶液中蛋白质浓度的测定l 1. UV法（1）280nm光吸收法 （2）280

15、nm和260nm的吸收差法（3）215nm和225nm的吸收差法l2. 双缩脲法l3. 福林一酚试剂法l4. 考马斯亮蓝G-250染色法l 二.多肽与蛋白质类药物的制备方法l6.纯度检查l确定protein 的纯度标准一般为：l 分子大小是否均一，电荷是否均一，是否具有恒定的氨基酸组成，是否具有单一的N端和C端残基，能否结晶，进一步纯化时生物活性是否有所提高等。二.多肽与蛋白质类药物的制造方法常用蛋白质纯度检查的方法有：l1HPLC或FPLCl2电泳均一性 l3免疫化学法 l4生物测定法二.多肽与蛋白质类药物的制造方法l5分光光度法（1）UV法（2）IR法l6高速离心法l7可结晶性l8N端，C

16、端的测定l9恒定的氨基酸比 返回目录三.重要的多肽与蛋白质类药物的制备l(一) 多肽类药物l1.胸腺激素l胸腺是一个激素分泌器官。对免疫功能有多方面 的影响。l胸腺位于纵隔腔上部，胸骨后方.l胸腺发生于胚胎第二个月。到出生二年内，生长迅速，体积较大，到青春期仍继续发育，青春期后发生萎缩。因此胸腺原料必须采自幼龄动物.三.重要的多肽与蛋白质类药物的制备l胸腺依赖性的淋巴细胞群T细胞直接参与 有关免疫反应lT细胞主司细胞免疫（机体在特异抗原的刺激下，以T细胞为主产生致敏淋巴细胞的免疫反应称细胞免疫）。主要胸腺激素制剂 名称化学性质 胸腺素组分5一族酸性多肽，MW100015000 猪胸腺素注射液多肽混合物，MW15000以下 胸腺素a1具有28个氨基酸残基的多肽， MW5562 ，pI4.2