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1、核酸测序技术基因工程研究所人类基因组计划（Human Genome Project HGP）于1990年正式启动，其主要目标有：识别 人类DNA中所有基因（超过10万个）；测定组成 人类DNA的30亿碱基对的序列；将这些信息储存 到数据库中；开发出有关数据分析工具；致力于 解决该计划可能引发的伦理、法律和社会问题。人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的 科学工程，它奠定了21世纪生命科学发展和现代 医药生物技术产业化的基础，具有科学上的巨大 意义和商业上的巨大价值。 杂交测序法 质谱法 单分子测序法 原子探针显微镜测序法 流式细胞仪测序法 大规模平行实测法、DNA芯片法 经典方法新技术方法 S
2、anger双脱氧链终止法(Sanger和 Coulson1977) Maxam-Gilbert DNA化学降解法 (Maxam 和Gilbert,1977)Sanger双脱氧链终止法nSanger于1977年在加减法测序的基础上创建 了双脱氧链末端合成终止法（chain termination method），简称Sanger法、双脱 氧法或酶法。一、基本原理n利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底 物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应 体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（ dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）作为链延伸终
3、止剂。在测序引物引导下，按照碱基配对原 则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸 链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离， 放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按53方 向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列 。双脱氧链终止法的测序基础是以双脱氧核苷三磷酸为测序反应的链终止剂。POHdNTPddNTPP OHOHPPPPOHn在4组相互独立的测序反应体系中，分别加入四 种不同ddNTP，其余成分相同。调整每个测序反 应中dNTP与ddNTP的比例，使引物的延伸在对应 于待测模板DNA每个可能掺入的位置都有可能发 生终止。n产生4组分别终止于互补链3末端的每一个A 、G、C和T位
4、置上的一系列长度的核苷酸链。 通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射 自显影检测，直接读出新合成DNA链的序列。双脱氧链末端终止法测序原理示意图 二、测序反应体系的组成（一）待测模板1单链模板DNA nSanger法使用的经典测序反应是将待测DNA片段 克隆于M13mp载体中，得到单链的DNA模板，再 按Sanger法进行测序。2双链模板DNA n将待测的DNA片断克隆到质粒载体上，得到含 待测DNA克隆片断的双链质粒，通过碱变性处 理，再与寡核苷酸引物序列一起退火，然后按 Sanger法进行测序。 nPCR产物（二）引物n在DNA聚合酶催化的测序反应中需要测序引物 。不论是单链DNA模板，
5、还是双链DNA模板，都 可通过使用克隆位点两侧的载体序列互补的“ 通用”引物。n通用引物的长度一般为1530个核苷酸。（三）DNA聚合酶1大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）n Klenow片段酶是Sanger法最早使用的DNA聚合酶，具有53聚合酶和3 5外切酶 活性，但它催化链延伸反应的能力较差，用它 进行测序常产生较高的本底和假带。 2测序酶（sequenase）n测序酶是一种经过修饰的T7噬菌体DNA聚合酶 ，消除了35外切酶活性。该酶活性非 常稳定，具有很高的链延伸能力和极快的聚 合反应速度，是测定较长DNA的首选酶。 3Taq DNA聚合酶 n Taq DNA聚合酶是P
6、CR反应的关键酶，在95的高温下保持稳定，可在高温下进行反应，该 酶用于测序具有很好的链延伸性能，能克服富 含GC序列的模板形成自身二级结构对测序的影 响。（四）放射性核素标记的dNTPn一般采用-32P-dNTP或-35S-dNTP作为标记物 。（五）测序产物的凝胶电泳及识读n能否将测序反应中产生的各种不同长度的DNA片 段进行有效分离是序列分析成败的关键。 三、Sanger双脱氧链终止法的特点1.快速简便，一次反应可测500个以上的碱基序列。2.荧光染料代替放射性核素标记，使该法便于实现自动化分析，能够满足绝大多数DNA样品序列分析的需要。四、毛细管电泳n毛细管电泳（Capillary e
7、lectrophoresis, CE） 是以高压直流电场为驱动力，在毛细管内使荷电 粒子按淌度或分配系数进行分离的一种电泳技术 。 n具有分辨率高、重现性好、灵敏度高、快速和易 于实现自动化等优点。 常用于DNA测序的毛细管电泳形式有以下几种：n（一）毛细管凝胶电泳n（二）非凝胶基质毛细管电泳n（三）阵列毛细管电泳（一）毛细管凝胶电泳n毛细管凝胶电泳（Capillary gel electrophoresis, CGE）是将平板电泳的凝胶移 到毛细管中做支持物进行电泳，由于电场强度比 板凝胶电泳大大提高，使分离时间缩短约25倍。nDNA测序中凝胶毛细管电泳柱主要以聚丙烯酰胺 凝胶作筛分介质，它
8、黏度大、抗对流，能减少 溶质的扩散，有极好的分离效果，除用于DNA序 列分析外，还可用于DNA片段的分离和PCR产物 的分析。n尽管CGE具有极好的分离效果，但存在一些问题 ，如制备凝胶柱费力，凝胶形成和电泳期间产 生的气泡影响分离，使用过程中焦耳热对分离 介质的降解使毛细管的寿命缩短等。（二）非凝胶基质毛细管电泳n为了避免CGE存在的问题，非凝胶基质毛细管电 泳用于DNA分析的研究越来越多，常见的有线性 聚丙烯酰胺和纤维素衍生物等非凝胶基质，这些 非凝胶基质在DNA测序中可以更换，使毛细管的 寿命延迟，在优化条件下可获得高效及高速的分 离效果。（三）阵列毛细管电泳n阵列毛细管电泳（Capil
9、lary array electrophoresis, CAE）是将毛细管电泳与板凝 胶电泳的优势相结合，采用毛细管凝胶电泳的装 置，将多支毛细管进行并列进行分离与检测，以 板凝胶电泳的优势弥补了毛细管凝胶电泳的不足 ，可一次检测多个样品。n阵列毛细管电泳散热效率高，适于高电场强度电 泳，是一种高速、高通量的测序法。使用非凝胶 基质，毛细管壁可以抑制横向扩散，具有易于实 现自动化的优点。激光测序法终止标记系统n激光测序法终止标记系统是用4种不同的荧光染料 标记不同的ddNTP。五、DNA自动化测序n测序反应可以在同一反应管内进行，不必分成4 管，反应产物按终止位置的碱基不同其3末端 带有不同的
10、荧光基团，被激发后产生不同的荧 光，将反应产物加样于凝胶的同一加样孔，电 泳分离后，经过DNA测序仪分析系统识别，将检 测将信号不断传送到计算机，通过软件分析， 自动读出待测DNA的全部核苷酸序列 。图10-5 激光测序法终止标记系统测序原理示意图 测序仪原理所谓BigDye Terminators是指美国应用生物系 统公司专利的四色荧光分别标记的起链终止剂作 用的四种ddNTPs，与四个反应管循环测序反应 及四个泳道电泳检测的传统双脱氧链终止法相比 ，实现了一个反应管完成反应与一个电泳道检测。 由于使用了四色荧光分别标记了四种ddNTPs， 可按照四种不同荧光来分别识别A、T、G、C， 因此
11、，可在一个反应管中完成循环测序反应， 并通过一个电泳道电泳即可完成测序任务。 1.荧光标记2.循环测序3.电泳与结果分析 染料受测序仪氩离子激光激发而发射出特定光 谱的四种不同颜色的荧光，同时，测序仪的专用 激光扫描镜头实时扫描不同大小的DNA片段在相 应时间通过垂直电泳胶读数区时发射的荧光，将 不同大小DNA片段发射的荧光实时地传递给计算 机测序数据实时收集软件，将电泳结果转换成胶 图文件及原始数据信号。当电泳完毕后，DNA序 列分析软件通过分析胶图文件及原始数据信号， 得到最终的测序结果。 377型遗传分析仪310型遗传分析仪3100遗传分析仪 3730遗传分析仪 六、DNA测序策略nDN
12、A的测序策略因待测DNA分子的性质、测序方法 和测序目的不同而有所不同。在测序之前，必须 根据待测序列区的长度，所要求的测序精确度以 及现有设施来制定测序总策略。 一、已知序列的确证性测序策略二、未知序列的从头测序策略一、已知序列的确证性测序策略n确证性测序（confirmatory sequencing）是对已 知的核酸序列进行鉴定和证实。n例如，在临床分子诊断中，对有遗传倾向的病例 检测相关基因有无突变，不仅有助于临床诊断， 还有助于探索有关疾病的发病机理及基因突变引 起的表型的变化。n多数情况下，确证性测序的DNA片段较小，一套反 应即可获得双链DNA其中一条链上局部区域的核苷 酸序列，
13、通常只需对亚克隆于M13噬菌体或噬菌粒 载体上的一段合适的限制酶切片段进行测序。n待测DNA片断位于通用引物的测序范围之内时，可 按克隆位点两侧的载体序列设计和合成寡核苷酸 片段作为“通用引物”；否则，最好的方法是合 成一段长度为18-20核苷酸的寡核苷酸引物，与距 离待测区约50-100核苷酸的序列互补。二、未知序列的测序策略n未知序列DNA的从头测序（de novo sequencing） 是指确定一个未知DNA序列的准确长度及核苷酸排 列顺序。n测序策略因待测DNA的长度而异，只有1kb左右的 待测DNA可选用定向测序法，过长的DNA可选用随 机测序法。（一）随机测序法n随机测序法（ra
14、ndom approach）包括鸟枪法与人 工转座子法。其共同特点是无特定方向性，随机 对靶DNA进行测序，最后通过计算机拼装而得到完 整的序列信息。1鸟枪法n鸟枪法（shotgun strategy）是利用超声处理、 核酸酶（DNase）切割或限制性酶切割，将长 链DNA随机断裂成适于测序的片段，把这些DNA片 段装入适当载体，建立亚克隆文库，含有子片段 的亚克隆扩增后分别进行DNA序列测定，然后将序 列重叠排列，确定待测DNA的完整序列。n该法所获得的序列由许多序列累积产生，结果准 确。但由于测序的亚克隆是随机挑选出来的，使 某些序列可能被多次重复测定，而一些序列一直 不出现，通常要测定比
15、实际靶DNA所含核苷酸多4 7倍的序列；如果靶DNA含较多的重复序列，计 算机将难以进行分析。（二）定向测序法n定向测序法（directed sequencing）是指从待测 DNA片段的某一端开始按顺序进行测序，直至将待 测DNA的序列全部测完。该类方法具有方向性，不 会出现大量重复测定的现象。定向测序法主要包 括嵌套缺失法和引物步入法。n嵌套缺失法（nested deletion）是利用工具酶酶解待 测DNA，只要控制消化时间，即可产生一组从同一端缺 失的长度不一的互套缺失突变体，测定其序列，通过相 互重叠部分将相邻片段的序列彼此拼接，如此重叠互套 ，获得待测DNA的全序列。1嵌套缺失法n
16、产生互套缺失突变体的主要工具酶有核酸外切酶III 、核酸酶Bal 31、DNA酶I和T4 DNA聚合酶。 用外切酶构建互套缺失突变体测序方法示意图 2引物步入法n引物步入法（primer walking ）是从待测DNA片 段的3端开始，利用载体上的序列设计第一次反 应的引物，测定一段DNA序列，然后依次根据前一 次测序结果，设计下一次反应引物，循序渐进测 序，直至完成，得到靶DNA的全部序列。引物步入法测序原理示意图 n基因组项目 (全程测序) 人，鼠，酵母，病原微生物，水稻，玉米等 ncDNA 测序 (EST 或全长测序) n比较测序或杂合子测序 n单核苷酸多态性（SNP）的发现与验证 n 突变检测 nBRCA, MSH2/MLH1, p53 n依据于测序的分型试剂盒 n应用于器官移植等的HLA 配型试剂盒 n应用于法医的线粒体测序 n指导临床治疗的HIV基因型检测试剂盒 n针对16S rRNA 的细菌鉴定试剂盒 n针对D2 rDNA 的真菌鉴定试剂盒 DNA 测序技
