实验三、 鸡胚细胞的原代培养• 一、培养细胞生长的条件 • 1、细胞的营养需要 • a、基本营养物质：氨基酸、维生素 • b、促生长因子等物质 • c、此外激素也可有助于细胞生长 • 培养液(medium)：培养基(培养液)是维持体 外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和 合成培养基血清(FBS，FCS，CS，HS)、 合成培养基， 如:DMEM、RPMI 1640和 Ham F12等 • 2、细胞的生存环境 • a、温度: 适宜的温度与取材的动物种类有关 • b、气相及pH: 5%CO2;pH: 7.2-7.4 • 3、无污染及无毒：无毒是培养细胞的必须 条件，细菌，病毒，支原体等• 二、 培养细胞的生长方式 • 1、贴附生长：必须贴附于支持 物表面才能生长见于各种实 体瘤细胞 • 2、悬浮生长：于悬浮状态下即 可生长，不需要贴附于支持物 表面各种造血系统肿瘤细胞每代贴附生长细胞的生长过程• 潜伏期 • 对数生长期 • 停止期（平台期）• 游离期： • 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态． 也称悬浮期此时细胞质回缩，胞体呈 圆球形 • 10分钟一4小时• 贴壁期： • 细胞附着于底物上，游离期 结束。
细胞株平 均在10分钟一4小时贴壁• 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等• 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘 素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正 电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上 ，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着• 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的 功能基团）• 潜伏期• 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂原代细胞持续约24-96 h，而肿瘤细胞或无限传代细胞仅需6-24 h• 对数生长期：• 细胞数随时间变化成倍增长，细胞增殖 旺盛，活力最佳，最适合进行实验研究 此期时间长短因细胞本身特性及接种 密度、血清浓度而不完全相同，一般可 持续3-5天• 停止期（平台期）：• 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但 不再分裂 • 细胞数目不再增加，但仍维持一定 时间的活力，此时应及时分离传代 ，否则细胞将因中毒而发生改变甚 至死亡 • 机制：接触抑制、密度依赖性提 纲1.关于原代培养的概念 2.原代培养的过程 3.原代培养的注意事项 4. 本次实验操作要点 5.实践操作原代培养 （primary culture）：也叫初 代培养，指直接从体内取出的细胞、组 织和器官进行的第一次的培养。
在首次 传代前的培养可认为是原代培养原代 培养的细胞生长比较缓慢原代培养的概念原代培养 • 优点：组织和细胞刚刚离体，生物性状尚 未发生很大变化，在一定程度上能反映体 内状态在供体来源充分、生物学条件稳 定的情况下，采用原代培养做各种实验， 如药物测试、细胞分化等，效果很好 • 缺点：原代培养组织是由多种细胞成分组 成的，比较复杂即使全为同一类型的细 胞，如上皮细胞或成纤维细胞，也仍具有 异质性，在分析细胞生物学特性时比较困 难原代培养方式• 组织培养 • 细胞培养 • 器官培养培养方式• 组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培 养瓶壁上，加入培养基后进行培养 • 分散细胞培养则是将组织块用机械法或化学 法使细胞分散如欲从胎儿或新生儿的组织 分离到活性最好的游离细胞，经典的方法是 用蛋白水解酶（如胰蛋白酶和胶原酶）消化 细胞间的结合物，或用金属离子螯合剂（如 EDTA）除去细胞互相粘着所依赖的Ca2+， 再经机械轻度振荡，使之成为单细胞培养方式• 器官培养：与组织培养相似，培养的是 器官的原基，器官的一部分或整个器官 ，以便能够在体外生存、生长和保持一 定功能的方法 传代培养• 原代培养形成的单层细胞汇合以后，需 要进行分离培养，否则细胞会因生成空 间不足或由于细胞密度过大引起营养枯 竭，都将影响细胞的生长，这一程序常 称为传代或传代培养。
将细胞从一个培 养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代 或传代培养原代培养在首次传代时即 为细胞系，能连续培养下去的为连续细 胞系；不能连续培养的为有限细胞系原代培养的过程取材——培养材料的制 备 ——接种——加培养液 —培养1.取材1）准备工作：A. 解剖取材器具、用品的清洗、包装 、灭菌B. 工作台面、工作环境的消毒C. 操作者本人的消毒：肥皂水刷手， 0.2%新洁尔灭浸泡前臂或者用酒精 擦拭消毒，穿工作衣，戴帽、口罩D.对实验动物消毒2.取材和培养材料的制备• A.切取合适大小的组织块或者器官，在平衡盐溶液或者培养液中洗涤，除去血污，剔除脂肪、被膜结缔组织以及坏死的组织可滴加培养液或者平衡盐溶液来保持湿润； • B. 将组织块放置于盛有培养液的培养皿中 ，剪碎，（接种），组织碎块和培养液一起移到离心管中，吸去上清液；C. 加入蛋白酶消化液，密封于37℃消化 ；D. 消化结束后，吸去含酶溶液，加入蛋 白酶抑制剂或者含有血清的培养基，终 止蛋白酶的活性；E. 用吸管吹打消化液，使单个细胞游离 ；F. 过滤离心收集单个细胞，以少量的培 养液重新悬浮细胞；G. 用计数板计算细胞密度，调节细胞密 度，接种。
取材注意事项1. 取材要准确； 2. 因“材”制宜进行处理； 3. 保持湿润； 4. 使用锋利的刀剪，防止细胞损伤 5. 动作快，耗时越少越好，可以使用 低温（4℃）3.接种与培养• A.植块培养定义：——将组织切割成一定大小的植块，接种到培养器皿中，加入培养液进行培养目的：——观察植块的组织学生长行为 ，——使植块细胞迁移并在植块外分裂增殖，取出植块后得到细胞培养物植块培养接种方法1.用湿润的吸管将植块小心吸取并轻轻吹 出到培养瓶中，按照一定的形式或者间 隔将植块排列好； 2.加入培养基，倒转培养一天； 3.待植块贴壁后，再倒转培养瓶，使植块 浸没在培养液中，继续培养； 4.观察细胞生长情况，按照生长情况更换 培养液• B分散细胞培养目的——反映了单个细胞的生物学特性——对单一细胞类型进行分离和纯 化接种方法： 1. 用吸管吸取一定量的细胞悬液，加入培 养器皿中，加入适量的培养液，封口 2. 恒温培养 3. 观察细胞生长状态，及时更换培养液• C悬浮细胞培养某些白血病细胞、腹水瘤细胞等对培养基不断搅拌或者对培养器皿进 行振荡、旋转而维持细胞的悬浮状态原代培养的注意事项• 1.培养液按照细胞生长情况，选择最适合的培养液；摸索需要补加的成分及添加量；培养体系的酸碱度；适当换液。
• 2.培养空间培养液体与液体上方的空间的体积比为1:10为宜液体的高度最好维持在2-5mm；本次实验内容用 品 器 材1.超净工作台内：污物缸1个、酒精喷壶1个、酒精灯2个、酒精棉球1瓶、大镊子1把、打火机1个、移液器1套1640培养基1瓶（方瓶，2人共用） 、Hank’s液 1瓶（圆瓶，2人共用）；剪刀一套，烧杯一个，培养瓶1包（2只） 、饭盒1只（内有胶塞、剪刀、培养皿、烧杯等），实 验 部 分器材：5ml枪头4支、培养瓶2只、10ml烧杯1只、培 养皿1套、中号镊子1只、小镊子1只、胶塞2只、 剪刀1把包装： 中镊/小镊/剪刀 1套 胶塞 单独包 2个培养皿 1套／包 10ml烧杯 1只 培养瓶 封口 2个放饭盒枪头塞好棉花，单独包， 标记：饭盒、瓶大小包、组号、姓名（ 1组2人）饭 盒实验准备工作• 洗手 • 照蛋，选活胚，画出气室（侧面 看清楚）如果表面污物较多， 可以用刀片刮除。
• 戴袖套 • 超净工作台表面消毒（酒精擦）无菌操作取材• 所有器皿（移液器）消毒，手部消毒后 晾干后，点燃酒精灯 • 将蛋置于蛋座（大头朝上），外表消毒 • 中镊尾部敲碎蛋壳，沿气室线剥开 注 意不让蛋壳碎屑落入蛋内 • 分别取3mL Hank’s液于培养皿（A，B） 大镊子夹瓶塞，用吸管取溶液) • 小镊剥内膜，挑出鸡胚于培养皿A• 于A中漂洗后转入B，再漂洗一遍，除去血块, 至清洗液澄清 • 左手中镊按住鸡胚，右手小镊剥取鸡胚皮肤 • 转入10ml的小烧杯，用小剪剪碎组织， 0.5~1mm3• 用吸管小心吸取组织碎块，接种于培养瓶生长 面（6个点）生长面10.翻转培养瓶，用另外一支吸管吸取 1640液4ml加于培养瓶 11.盖塞子，平放拿出超净台 12.培养瓶侧面标记清洗用具，交回 13. 37℃培养，第二天小心翻转培养瓶 培养一周24h含鸡胚鸡蛋示意图操作示意图标记气室示意图培养中的人成纤维细胞注意事项• 1. 自取材开始，保持所有组织细胞处于 无菌条件细胞计数可在有菌环境中进行 • 2．操作前要洗手，进入超净工作台后手 要用75%酒精擦试，试剂瓶等也要擦试 • 3. 凡在超净台外操作的步骤，各器皿需 用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。
• 4. 在超净台中，组织细胞、培养液等不 能暴露过久，以免溶液蒸发 • 5. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行， 耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器 械烧灼时间不能太长，并冷却后才能夹 取组织，吸取过营养液的用具不能再烧 灼，以免烧焦形成碳膜 • 6．打开瓶口前，瓶口火焰消毒；吸取液 体前，瓶口火焰消毒；吸取液体时，避 免瓶口和吸管这碰撞瓶子开口后要尽 量保持45°斜位吸溶液的吸管等不能混 用• 7．操作动作要准确敏捷，但又不能太 快，以防空气流动，增加污染机会 • 8．不能用手触已消毒器皿的工作部分 ，工作台面上用品要布局合理 • 9. 实验者离开超净台时，要随时用肘 部关闭工作窗作 业• 实验报告包括今天实验的步骤，要对今天的实验过程和 结果进行分析预习下节课内容：标本观察 1、组织块法培养细胞的观察 培养24h后，倒置 显微镜下可观察到少量的细胞从组织块边沿 游离出来;48h后，可见大量的细胞放射状排 列与组织块周围，这些细胞细胞核较大，细 胞质内含物少，透明度高，彼此间排列紧密 。