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1、第六章 基因工程菌苗 (gene engineering bacteria vaccine)第一节 概述 (Section I outline)1883年-1885年巴斯德（Pasteur）用理化和生物学方法制 备了减毒的炭疽菌苗和狂犬疫苗等。19世纪以来用菌苗免疫人畜，明显减少了传染病的发生。 其中比较成功的是破伤风、白喉类毒素疫苗的应用，其效 果可达95%以上。在发达国家破伤风、白喉、百日咳、嗜 血性流感的发病率明显降低。抗菌药物的发明和应用，使 临床常见的细菌性感染和病死率大幅下降。 细菌一旦获得耐药性，存在与细菌染色体、质粒和转座子中的耐药基因就可通过转化、转导、接合和转座等方式，将抗
2、性基因传播到其他敏感菌，使之成为抗药菌株，给临床传染病的治疗带来困难。据WHO1996年报告，全球每年死亡约5190万人，其中1/3约1730万死于传染病。 在过去20年中，有29种新传染病出现。美国Satcher博士在Emerging Infectious Diseases杂志创刊刊号列出自1973年以来鉴定的主要传染病或病原体22种。近年鉴定的新病原体和疾病鉴定年份依次列于表5-1。表6-1 新鉴定的病原体 年份病原体所致疾病1975微小病毒B19(pawovirus B19)5号病，慢性溶血性贫血 中的再障危象1976隐孢子虫（cryptosporidium）隐孢子虫病，急性小肠 结肠炎
3、1977埃博拉病毒（ebolavirus）埃博拉出血热1977军团病杆菌（legionellapneumophila）军团病1977汉坦病毒（hantsann virus）肾综合症出血热1977弯曲杆菌（campylobacter）空肠弯曲杆菌肠炎1980人嗜T淋巴细胞病毒（HTLV-1）T细胞淋巴瘤白血病1981葡萄球菌毒素（toxin producing aureus） 中毒性休克综合症 1982 大肠杆菌O157：H7（E.coli O157:H7） 出血性肠炎，溶血性尿 毒综合症 1982 HTLV-II 毛皮样细胞白血病 1982 伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorfer
4、i） 莱姆病 1983HIV艾滋病1983幽门螺杆菌（Helicobacter pylori ）胃溃疡1988人疱疹病毒6型（HHV-6）突发性玫瑰疹1989查菲氏欧利希氏体人欧利希氏病1989丙型肝炎病毒（hepatitis C）丙型肝炎1990 戊 型肝炎病毒（hepatitis E） 戊型肝炎1991Guonarito病毒委内瑞拉出血热1992霍乱弧菌O139地方性流行性霍乱1992巴尔道氏体（Bartonella henselae ）猫抓病、细菌性血管瘤病1992环形孢子环形孢子虫病1993汉坦病毒分离株汉坦病毒综合症1993Sin nombre virus1994 Sabia病毒 巴
5、西出血热 1995庚型肝炎病毒（hepatitis G）庚型肝炎1995人疱疹病毒8型（HHV-8）卡波济肉瘤，淋巴瘤1996朊病毒（prion）(BSE,TSE)传染性海绵状脑病，克雅病1997TT病毒（TT Virus）TTV肝炎1999尼巴病毒（nipah virus）发热性脑炎1999伊氏埃立克体（Ehrlichia ewingii ）人埃立克体病 新病原体不断出现与鉴定，新的疫苗研制也相继开始。 重要病原体全基因测序的开展和完成，及类似生物表型的不同菌属间的同源序列和异源序列的发现，对抗感染研究来说，像进行了一场革命，不仅会促进病原体致病和发病机制的研究，也会开阔和调整菌苗研究的策略
6、和思路。 目前已完成500余种病毒的全基因测序，关于重要病原菌全基因测序进展情况列于表5-2。 完成的正在进行的将要进行的 流感嗜血杆菌（ Haemophilus influenzae）放线性放线菌（ Actinobacillus actinomycetemcomitans）弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）生殖道支原体（ Mycoplasma genitolium）枸巢曲霉杆菌（ Aspergillus midulans）流产布氏杆菌（Brucella abortus）肺炎支原体（ Mycoplasma pneumoniae）枯草杆菌（Bacillus subtilis）杜
7、克雷嗜血杆菌（Haemophilus ducreyi）幽门螺杆菌（ Helicobacter pylori ）沙眼衣原体（Chlamydia trachomatio） 鸟分枝杆菌（Mycobacterium avium） 伯氏疏螺旋体（ Borrelia burgdorferi） 粪肠球菌（Enterococcus faecalis, E.faecium） 多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida） 表6-2 人类重要病原菌全基因测序现状 E.coli K12军团菌（Legionella pneumopbila）牙龈卟啉单胞菌 （Porphyromonas gingvalis）
8、肺炎球菌（ Streptococcus pneumoniae）麻风分枝杆菌（Mycobacterun leprae）鼠伤寒沙门氏菌 （Salmonella serotype Typhimurium）梅毒螺旋体（ Treponeme pallidun）淋病脑膜炎奈瑟氏球菌（ Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis）布氏锥虫（ Trypanosoma brucei） 解脲原体（Ureoplasma urealyticum）亚性疟（plasmodium falciparum ）痢疾杆菌（Shigella） 绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）
9、 大型利什曼原虫（ Leishmania major） 金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus） 霍乱弧菌（Vibrio cholerae） 化脓链球菌（Streptococcus pyogenes） 总之，已控制传染病的再现及新传染病的出现，已引起全球的注意，对传染病威胁需要再认识，已有共识。因此，有必要加快进行创新性的细菌菌苗的研制与开发。第二节 目前应用的菌苗及其存在问题 Present bacteria vaccine and the questionl一、目前应用菌苗的类别(The type of bacteria vaccine) l 按菌苗所含的成份，菌苗可
10、分为九类 ，即减毒的活菌苗、灭活的死菌苗、纯 化的多糖或蛋白成份苗、基因缺失活菌 苗、载体重组活菌苗、核酸菌苗、联合 重组菌苗、多价菌苗、多糖与蛋白结合 菌苗。 1、减毒的活菌苗（Attenuated bacteria vaccine） 如卡介苗（BCG），是巴斯德研究院A. Calmette 和Guerin,C等（1921）将一株牛型强毒结核菌在甘 油-胆汁-马铃薯培养基上传230代后（13年），获 得的对动物不致病，但产生抗结核免疫反应的菌苗 即BCG。对免疫婴幼儿有保护效果。 后来发现对成人的保护效果波动范围很大，对其 减毒机制始终不清。直至近年来完成结核分枝杆菌 全基因测序后，与有毒牛
11、型结核分枝杆菌全基因序 列进行比较，方知BCG缺失了毒力相关基因。 总之，对胞内菌目前还是用减毒的活菌苗。 2.灭活菌苗 （Dead bacteria vaccine） 通过加热处理或福尔马林（formaldehyde）、戊二醛（glutaraldehyde）、-内酯（-propiolactone）、等化学处理得到 如霍乱死菌苗，百日咳（Bordetella pertussis）死菌苗等。死菌苗的主要优点是稳定，缺点是需要多次免疫才能得到好的保护效果。 3.亚单位或成分苗 （Subunit bacteria vaccine）从细菌培养液中提取、用化学方法脱毒的类毒素苗，如破伤风类毒素（TT）、
12、白喉类毒素（DT），免疫后诱导机体产生的抗血清能特异中和TT破伤风类毒素或DT白喉类毒素，其保护效果可达95%以上。由于毒素纯化方法的改进，产品的副作用很小； 荚膜细菌纯化的多糖菌苗，可诱导产生的抗体能保护机体抵抗入侵荚膜菌的感染。如嗜血性流感杆菌b(Hib)、伤寒杆菌Vi多糖等多糖苗，能诱导机体产生T细胞非依赖的抗体反应，其特点是诱导产生短期的IgM抗体，缺乏免疫记忆，对不到18个月幼儿的多糖苗免疫原性差，而没有保护效果。因此多糖类的菌苗急需改进。 目前，将多糖与载体蛋白共价连接，通过载目前，将多糖与载体蛋白共价连接，通过载体蛋白提供适当的体蛋白提供适当的T T细胞表位，由细胞表位，由T T
13、细胞协助细胞协助B B细细胞产生多糖特异性抗体，使胞产生多糖特异性抗体，使T T细胞非依赖性抗原细胞非依赖性抗原转变为转变为T T细胞依赖抗原，这类菌苗称为细胞依赖抗原，这类菌苗称为多糖多糖- -蛋蛋白结合苗白结合苗。如。如嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌HibHib的结合苗已在几的结合苗已在几个国家获得证书个国家获得证书，证明对不到，证明对不到1818个月的儿童有个月的儿童有很高的免疫原性，能诱导免疫记忆，免疫球蛋很高的免疫原性，能诱导免疫记忆，免疫球蛋白的类型转换及抗体亲和力成熟，明显减少白的类型转换及抗体亲和力成熟，明显减少HibHib菌的入侵感染与发病。菌的入侵感染与发病。表6-3 目前可用于
14、人群的菌苗 菌苗 类型预防的疾病 国内 国外 1卡介苗（BCG）活菌苗结核病i.di.d 2布氏病菌苗（ 104M）活菌苗布氏菌病d.s3鼠疫菌苗（EV ）活菌苗鼠疫d.s4 炭疽菌苗（ A16R,CTN- 1,V770-NP-1） 活芽胞苗 炭疽 d.s 炭疽菌苗 灭活菌苗 炭疽 s.c 菌苗 类型预防的疾病 国内国外 5 百日咳菌苗 类毒素 灭活菌苗 百日咳 炭疽 i.m i.m 6脑膜炎球菌苗（A、C 群） 多糖成分 脑膜炎 i.m s.c 7脑膜炎球菌苗（ A/C/Y/W-35群） 多糖成分 脑膜炎 s.c 8流脑A群多糖-破伤风 蛋白结合菌 苗多糖-蛋白结 合苗 流行性脑脊 髓膜炎
15、i.m 9伤寒菌苗（Ty21a） 伤寒菌苗（Ty21a） 伤寒Vi多糖苗 活菌苗 灭活全菌苗 多糖成分 伤寒 伤寒 伤寒 i.m p.o s.c i.m 10精制破伤风菌苗 类毒素 破伤风i.m i.m 11精制白喉菌苗 类毒素 白喉 i.m 菌苗 类型预防的疾病 国内国外 12 白-百-破三联苗（ DTP） 类毒素 白喉，百日咳 i.m 灭活全苗 破伤风 i.m 13 白-破-百三联（DTaP ） 类毒素 白喉，百日咳 i.m 白-破-百三联苗 灭活全苗 破伤风 i.m 14 白-破二联苗（DT或 Td） 类毒素 白喉，破伤风i.m i.m 15 钩端螺旋体菌苗 外膜成苗 钩端螺旋体病 s.
16、c 16 霍乱弧菌（O139） 灭活全菌 苗 霍乱 s.c S,c/i. d 17 CVD103HgR 基因工程 活苗 霍乱 p.o 18 肺炎球菌（23型） 多糖成分 肺炎 p.o菌苗 类型预防的疾病 国内国外 19嗜血流感杆菌B型（ Hib）类毒素脑膜炎i.m20DTP-嗜血流感杆菌B 型结合苗灭活的全菌 苗白喉，百日 咳，i.m（DTP-Hib）细菌多糖-蛋 白结合菌苗破伤风，脑 膜炎i.m21福氏2a与宋内双价痢 疾菌苗（FSM2117）基因工程活 苗痢疾p.oF2a与宋内双价痢疾 菌苗（FS）基因工程活 苗痢疾p.o22莱姆病菌苗（OspA）重组OspA莱姆病s.c注：i.d皮内，s.c皮下，d.s划痕，i.m肌注，p.o口服 （二）研制菌苗的新方法（New method of produce bacteria v
