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1、第四节 黄酮类化合物的检识与结构 鉴定目前主要采用的方法有： 与标准品或与文献对照PPC或TLC得到 的Rf或hRf值（Rf100） 分析对比样品在甲醇溶液中及加入诊断 试剂后得到的UV光谱 1H -NMR 13C -NMR MS一、色谱在黄酮类鉴定中的应用一、色谱在黄酮类鉴定中的应用1. 1. 纸层析纸层析(PPC)(PPC)n n苷类成分可采用双向展开，第一相展开采用苷类成分可采用双向展开，第一相展开采用 醇性溶剂，如醇性溶剂，如BAWBAW系统（正丁醇：系统（正丁醇： 醋酸：醋酸： 水水4 4：1 1：5 5上层）；第二相展开用水性溶剂上层）；第二相展开用水性溶剂 ，如氯仿：醋酸：水（，
2、如氯仿：醋酸：水（3 3：6 6：1 1）苷元则多采用醇性溶剂。苷元则多采用醇性溶剂。花色苷及其苷元，可用含盐酸或醋酸的溶剂花色苷及其苷元，可用含盐酸或醋酸的溶剂 。n n显色剂：显色剂：2%2%三氯化铝甲醇液（紫外光下检三氯化铝甲醇液（紫外光下检 测）；测）； 1%FeCl1%FeCl3 3 / / 1%K1%K3 3Fe(CN)Fe(CN)6 6(1:1)(1:1)混合液混合液 。2. 2. 薄层层析薄层层析(TLC)(TLC)）硅胶薄层）硅胶薄层用于弱极性黄酮较好。用于弱极性黄酮较好。常用甲苯：甲酸甲酯：甲酸（常用甲苯：甲酸甲酯：甲酸（5 5：4 4：1 1） ；苯：甲醇（；苯：甲醇（9
3、595：5 5）或苯：甲醇：冰醋）或苯：甲醇：冰醋 酸（酸（3535：5 5：5 5）等。）等。）聚酰胺层析n适用范围广，可分离含游离酚羟基或其 苷类。n常用展开系统：乙醇：水（3：2）；丙 酮：水（1：1）等。二、紫外光谱在黄酮类鉴定中的应用二、紫外光谱在黄酮类鉴定中的应用n n可用于确定黄酮母核类型及确定某些位置是否含可用于确定黄酮母核类型及确定某些位置是否含 有羟基。有羟基。n n一般程序：一般程序：测定样品在甲醇中的测定样品在甲醇中的UVUV谱以了解母核类型；谱以了解母核类型；在甲醇溶液中分别加入各种诊断试剂后测在甲醇溶液中分别加入各种诊断试剂后测UVUV谱谱 和可见光谱以了解和可见光
4、谱以了解3,5,7,3,43,5,7,3,4有无羟基及邻二酚羟有无羟基及邻二酚羟 基；基；苷类可水解后（或先甲基化再水解），再用上苷类可水解后（或先甲基化再水解），再用上 法测苷元的法测苷元的UVUV谱以了解糖的连接位置。谱以了解糖的连接位置。（一）黄酮类化合物在甲醇溶液中的紫外光谱（一）黄酮类化合物在甲醇溶液中的紫外光谱n n多数黄酮类化合物由两个主要吸收带组成：多数黄酮类化合物由两个主要吸收带组成：带带I I在在300-400nm300-400nm区间，由区间，由B B环桂皮酰系统的电环桂皮酰系统的电 子跃迁所引起。子跃迁所引起。B B B B带带II II在在240-285nm240-2
5、85nm区间，由区间，由A A环苯甲酰系统环苯甲酰系统 的电子跃迁所引起。的电子跃迁所引起。A AA A带II(240- 285nm)（苯 甲酰系统）带I(300- 400nm) 桂皮酰系统类 型说 明250-285304-350黄酮类-OH越多，带 I带II越红移B环3,4有- OH基，带II 为双峰（主 峰伴肩峰）328-357黄酮醇类 (3-OR)352-385黄酮醇类 (3-OH)245-270 270-295300-400异黄酮类 二氢黄酮 （醇）B环上有-OH, OCH3对带I 影响不大220-270340-390 或340-390(Ia)300-320(Ib)查耳酮类查耳酮2-O
6、H 使带I红移的 影响最大370-430(3-4 个小峰)橙酮类 不不 同同 类类 型型 黄黄 酮酮 类类 化化 合合 物物 的的 紫紫 外外 光光 谱谱2 2加入诊断试剂后引起的位移及结构测定加入诊断试剂后引起的位移及结构测定加入试剂带II带I说明样品+MeOH （黄酮类及 黄酮醇类）250-285304-385两峰强度基本相同，具体位置 与母核上电负性取代基(-OH, - OCH3)有关，-OH, -OCH3越多 ，越长移+NaOMeA环有- OH，红 移小， 无意义40-60nm （不变或 增强） 50-60nm （下降）有4-OH，无3-OH有3-OH，无4- OH有3,4-OH或3,
7、3,4-OH（衰减 更快）7-OH带I，II随加NaOMe时间 延长，逐渐衰减320-330nm 有吸收，成 苷后消失+NaOAc (未熔融)5-20在长波一侧 有明显的肩 峰7-OH+NaOAc (熔融) 4065有4-OH+NaOAc/ H3BO35- 1012-30有6,7-OH或7,8-OH (5,6-OH无) B环有邻二酚羟基AlCl3/ HCl60 50-60 35-55 17-20 0有3-OH 有3,5-二OH 有5-OH，无3-OH 有6-OR 无3-OH, 5-OHAlCl3光谱- AlCl3/ HCl光谱30-40 50-65 0B环有邻二酚羟基 A,B环皆有邻二酚羟基
8、A,B环皆无邻二酚羟基说明：说明：（1 1）+ +NaOMeNaOMe或或NaOAcNaOAc, , OHOHONaONa，变为离变为离子化合物，共轭系统中的电子云密度增加子化合物，共轭系统中的电子云密度增加 ，红移，红移另有另有3,4-OH3,4-OH或或3,3,4-OH3,3,4-OH时，在时，在NaOMeNaOMe作作用下易氧化破坏，故峰有衰减。用下易氧化破坏，故峰有衰减。（2 2）NaOAcNaOAc为弱碱，仅使酸性较强者，如为弱碱，仅使酸性较强者，如 7,4-OH7,4-OH解离。解离。（3 3）形成络合物的能力： 黄酮醇3-OH 黄酮5-OH（二氢黄酮5-OH） 邻二酚 羟基 二氢
9、黄酮醇5-OH 邻二酚羟基和二氢黄酮醇5-OH在酸性条件下不与 AlCl3络合； 但不在酸性条件下，五者皆与Al3+络合； 形成络合物越稳定，红移越多。（4） 根据只加AlCl3和加入AlCl3及盐酸的紫外光谱吸收峰位相减的结果，可以判断邻二酚羟基 的取代情况。山柰苷山柰苷 山柰酚山柰酚 UVmax(nm) UVmax(nm) 带带II II 带带I I 带带II II 带带I I MeOHMeOH 265 265 345345 267 267 367367 NaOMeNaOMe 265 265 388388 278 278 416416（分解分解 ） AlCl3AlCl3 275 275 3
10、99399 268 268 424424 AlCl3/HClAlCl3/HCl 275 275 399399 269 269 424424 NaOAcNaOAc 265 265 399399 276 276 387387 NaOAc/HNaOAc/H3 3BOBO3 3 265 265 345345 267 267 367367从中药柴胡中分离得到山柰苷，经酸水解后， 用PC检出有鼠李糖，山柰苷及山柰酚的紫外光 谱数据如下：山柰酚3，7-二鼠李糖苷三、三、1 1H-NMRH-NMRn n常用溶剂：氘代氯仿（常用溶剂：氘代氯仿（CDDlCDDl3 3），），氘代二氘代二 甲基亚砜（甲基亚砜（DM
11、SO-dDMSO-d6 6），），氘代吡啶（氘代吡啶（C C5 5D D5 5N N）。）。n n也可将黄酮类化合物制成三甲基硅醚衍也可将黄酮类化合物制成三甲基硅醚衍 生物溶于四氯化碳中进行测定。生物溶于四氯化碳中进行测定。黄酮类化合物1H-NMR谱(DMSO-d6)羟基的特征5OH：12 ppm7OH：11 ppm3OH：10 ppmn氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）对鉴别黄 酮母核上的酚羟基，是十分理想的溶剂 ，在试样中加入重水（ D2O）羟基质子 信号消失。（一）（一）A A环质子环质子1 15, 7-5, 7-二二-OH-OH黄酮黄酮黄黄酮类酮类1 1H-NMRH-NMR （三甲基硅醚
12、衍生物溶于四氯化碳中测定）三甲基硅醚衍生物溶于四氯化碳中测定）n当7-OH成苷时，则H-6及H-8信号均向低场方向位移。2 27-OH7-OH黄酮黄酮H-5较H-6、H-8低场，是由于羰基的负屏蔽 效应的影响。 H-6、H-8较5, 7-二OH黄酮在较低场，且相 互位置可能颠倒。 （二）（二） B B环质子环质子 6.5-86.5-81 14-4-氧取代黄酮类化合物氧取代黄酮类化合物H-3, 5 6.5-7.1, d, J=8.5Hz H-2, 6 7.1-8.1, d, J=8.5Hz 由于C环对H-2, 6的负屏蔽作用大于对H-3, 5， 且H-3, 5受4-OR的屏蔽作用，故前者较低场；
13、 C环氧化程度越高，H-2, 6处于越低场的位置。2 23, 4-3, 4-二氧取代黄酮类化合物二氧取代黄酮类化合物 H-2受C环负屏蔽和3-OR屏蔽作用，H-6 也受C环 负屏蔽作用，而H-5则仅4-OR屏蔽作用。故由低场 到高场的顺序为：H-6 H-2 H-5。 但有时也会发生H-2和H-6重叠的现象。（1）3, 4-二氧取代黄酮及 黄酮醇H-5 6.7-7.1 d, J=8.5HzH-2 7.2 d, J=2.5HzH-6 7.9 dd, J=2.5, 8.5Hz（2 2）3, 3, 4-4-二氧取代异黄酮、二氢黄酮及二氧取代异黄酮、二氢黄酮及 二氢黄酮醇二氢黄酮醇H-2, H-2, 5
14、,65,6常作为一个复杂多重峰（通常常作为一个复杂多重峰（通常 为两组峰）为两组峰） 6.7-7.16.7-7.13 33, 4,5-3, 4,5-三氧取代黄酮类化合物三氧取代黄酮类化合物若R1=R2=R3=H，则H-2,6为单峰， 6.7-7.5 若上述条件不成立（如3或5甲基化或苷化时 ），则H-2,6分别为二重峰（J=2Hz） （三）（三） C C环质子环质子1. 1. 黄酮类黄酮类2. 2. 异黄酮类异黄酮类H-2位于羰基位，同时受羰基和苯环的负屏 蔽作用，且通过碳与氧相连，故较一般芳香 质子低场，7.6-7.8。 若用DMSO-d6作溶剂，则8.5-8.7。 3. 3. 二氢黄酮和二氢黄酮醇二氢黄酮和二氢黄酮醇1) 1) 二氢黄酮二氢黄酮两个H-3, 分别为dd峰，中心位于2.8 ，J = 17Hz（偕偶），5Hz（顺偶）及J = 17Hz（偕 偶），11Hz（反偶）H-2, dd, 5.2, Jtrans = 11Hz （反偶）, Jcis = 5Hz（顺偶）（2 2）二氢
