第九章维生素类药物的分析

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1、第九章 维生素类药物的分析概 述一、定义维生素是维持人体正常代谢功能所必需的微量生物活性物质，主要用于机体的能量转移和代谢调节，体内不能自行合成，必须从食物中摄取。 VitA、D2、D3、 E、K1 等 脂溶性水溶性VitB族 (B1、B2、B6、B12)VitC、叶酸、烟酸、烟酰胺VitMVitPP二、分类 三、分析方法 本类药物的分析方法很多，有生物法、微生物法、化学法和物理化学法，多依据其生物特性及理化性质进行，但目前常用的分析方法是化学法或物理化学法。第一节 维生素A（Vitamin A）维生素A包括有维生素A1（视黄醇）、去氢维生素A（维生素A2 ）和去水维生素A（维生素A3）等，其

2、中维生素A1活性最高，维生素A2的生物活性是维生素A1的30-40%，维生素A3的生物活性是维生素A1的0.4%，故通常所说的维生素A系指维生素A1。-H 维生素A醇-COCH3 维生素A醋酸酯-COC15H31 维生素A棕榈酸酯R :一、结构和性质1、为一个具有共轭多烯侧链的环己烯v （1）具有UV吸收v （2）存在多种立体异构化合物v （3）易发生脱氢、脱水、聚合反应v 或有金属离子存在时更易氧化2、不稳定性3、与三氯化锑发生呈色反应CHCl34、溶解性不溶于水易溶于有机溶剂和植物油等1、三氯化锑反应CHCl3二、鉴别试验维生素A在饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液中呈现不稳定的蓝色，再变为紫

3、红色。 反应条件： 要求无水，如存在水可能产生氯化氧锑（ SbOCl ）。 配制所用的氯仿不能含醇（应用无醇氯仿）和光气（COCl2）。 三氯化锑有腐蚀性。2、紫外吸收光谱维生素A分子中含有5个共轭双键， 其无水乙醇液在326nm波长处有最大吸 收。当在盐酸催化下加热，即发生脱水 反应生成去水维生素A（A3）。去水维 生素A比维生素A多一个共轭双键，其最 大吸收波长向红移，在340390nm波 长间出现3个最大吸收峰。 3、薄层色谱三、含量测定1、紫外分光光度法利用维生素A醇和其醋酸酯分子中具多烯共轭体系结构，在325328nm处有选择性吸收峰，故可进行含量测定。立体异构体氧化产物及光照产物合

4、成中间体去氢维生素A（ VitA2）去水维生素A（ VitA3）均对测定有干扰，故采用三点校正法三点校正法（1）条件： 杂质的吸收在310340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小； 物质对光的吸收具有加和性。（2）波长的选择： 1 VitA的max（328nm） 2 3 分别在1的两侧各选一点（3）测定方法： 第一法（直接测定法）测定对象 VitA醋酸酯 第二法（皂化法）：用醇制氢氧化钾加热皂化（水解），用乙醚提取，挥干溶剂，残渣用异丙醇溶解，测定含量。测定对象 VitA醇第一法 第二法测定对象 维生素A醋酸酯 维生素A醇方法 直接取样，测定 皂化提取，测定溶剂 环己烷 异丙醇

5、max 328 nm 325 nm测定波长 5个 4个换算因数 1900 1830第一法与第二法的区别（二）三氯化锑比色法维生素A可与三氯化锑的氯仿溶液作用，产生蓝色，在618620nm波长处有最大吸收。可用于维生素A的比色测定。要求在510秒内测定。本法缺点多，已被UV法取代。（三）高效液相色谱法氨基嘧啶环CH2噻唑环(季铵碱)HClCl-维生素B1（盐酸硫胺）第二节 维生素B1的分析（1）溶解性易溶于水水溶液呈酸性（2）UV共轭双键max = 246nm（一）结构与性质嘧啶环 伯氨噻唑环 季铵1、可与酸成盐2、与生物碱3、含量测定 非水碱量法（3） 硫色素反应（4） 碱性（二）鉴别试验1、

6、硫色素反应（VitB1的专属反应） VitB1H+H+H+H+2、沉淀反应1、非水溶液滴定法（药典用于测定原料药）v 原理：利用噻唑环上季铵和嘧啶环上氨基的弱碱性，在非水溶液中用高氯酸液滴定。（三）含量测定2、UV分光光度法（药典用于测定片剂、注射剂）（1）原理：维生素B1分子中具有共轭双键结构，具有紫外吸收特征，可在其最大吸收波长下测定吸收度，根据取样量计算含量。（2）方法NaOH（三）硫色素荧光法原理原理（1）激发波长365nm发射波长435nm（2 2）方法与计算）方法与计算+ NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 + NaOH + 异丁醇+ NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 + NaO

7、H + 异丁醇SdAb对照液供试液（3 3）特点）特点灵敏度高，线性范围宽代谢产物不干扰，适用于体液分析L抗坏血酸第三节 维生素C的分析 易溶于水 水溶液呈酸性(一）结构与性质1、溶解性C3OH的 pKa = 4.17C2OH的 pKa = 11.572、酸性一元酸二烯醇结构二酮基结构二烯醇结构3、强还原性L(+)抗坏血酸 活性最强手性C（C4、C5）4、光学活性* *糖类的显色反应50结构与糖类相似5、具糖的性质6、UV特征（二）鉴别试验1、与AgNO3反应2、与2，6 - 二氯靛酚反应(ChP2000)氧化型玫瑰红色还原型蓝色 OH(ChP2000)3、与碱性酒石酸铜反应USP4、与KMn

8、O4反应5、糖类的反应6、紫外分光光度法（三）杂质检查（略）1、溶液的澄清度与颜色检查2、铁、铜离子的检查：原子吸收分光光度指示剂 淀粉指示液原理（1）1、碘量法（四）含量测定取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6（2）方法 酸性环境 d . HCl 新沸冷H2O减慢VitC被O2氧化速度（3）讨论 立即滴定 减免水中O2的干扰减少O2的干扰（二）2，6 - 二氯靛酚钠滴定法USPJP原理（1）自身

9、指示终点法（2）方法快速滴定 2min内 酸性环境 HPO3-HAc 稳定VitC防止其他还原性物质干扰剩余比色测定 （定量过量）（测剩余染料）（3）讨论（4）缺点 需经常标定贮存一周不稳定干扰多 氧化力较强（三）高效液相色谱法维生素D是一类抗佝偻病维生素的总称。目前已知的维生素D类物质至少有十种之多，它们都是甾醇的衍生物。中国药典主要收载有维生素D2、D3原料药；维生素D2胶丸和注射剂；维生素D，注射剂。USP(24)收载有片剂、胶囊、口服液等剂型。BP(2000)收载的剂型有片剂、口服液、注射液以及钙与维生素D2、D3制成的复方片剂。 第四节 维生素D的分析(一)结构维生素D2为9，10-

10、开环麦角甾5，7，10(19) ，22-四烯3-醇，又名骨化醇或麦角骨化醇。维生素D3为9，10-开环胆甾-5，7，10(19) 三烯-3-醇，又名胆骨化醇。两者的化学结构十分相似，其差别仅是维 生素D2比维生素D3在侧链上多一个双键，C24上 多一个甲基。 一、结构与性质VD2VD3(二)性质1、性状 维生素D2、D3均为无色针状结晶或白色结晶 性粉末；无臭，无味；遇光或空气均易变质。 2、溶解性 维生素D2在氯仿中极易溶解，在乙醇、丙 酮或乙醚中易溶；维生素D3在乙醇、丙酮、氯仿或乙醚中 极易溶解；二者均在植物油中略溶，在水中不溶。3、不稳定性 维生素D2、D3因含有多个烯键，所以极 不稳

11、定，遇光或空气及其他氧化剂均发生氧化而变质，使 效价降低，毒性增强。本品对酸也不稳定。4、旋光性 维生素D2具有6个手性碳原子，而维生素 D3有5个手性碳原子，所以二者均具有旋光性。 5、显色反应 本品的氯仿溶液，加醋酐与硫酸，初显黄色，渐变红色，迅即变为紫色，最后变为绿色。本反应为甾类化合物的共有反应。6紫外吸收特性 取本品，加无水乙醇溶解并定量稀释释制成每10ml中约约含10ug的溶液。照分光光度法，在265nm的波长处测长处测 定吸收度，维维生素D2的吸收系数为为460-490；维维生素D3的吸收系数为为465-495。(一)显显色反应应1、与醋酐酐浓浓硫酸反应应 取维维生素D2或D3约

12、约0.5mg， 加氯氯仿5m1溶解后，加醋酐酐0.3ml与硫酸0.1ml，振摇摇，维维生素D2初显显黄色，渐变红渐变红 色，迅即变为变为 紫色，最后成绿绿色。 维维生素D3初显显黄色，渐变红渐变红 色，迅即变为变为 紫色、蓝绿蓝绿 色， 最后变为绿变为绿 色。2、与三氯氯化锑锑反应应 取本品适量(约约1000单单位)，加 1，2-二氯氯乙烷烷1m1溶解，加三氯氯化锑试锑试 液4ml，溶液即显显橙 红红色，逐渐变为渐变为 粉红红色。3、其它显显色反应应 维维生素D与三氯氯化铁铁反应应呈橙黄色 ，与二氯氯丙醇和乙酰氯试剂酰氯试剂 反应显绿应显绿 色，均可用于鉴别 ，但专属性不强。 二、鉴别试验(二

13、)比旋度鉴别取维生素D2，精密称定，加无水乙醇溶解并定量稀释制 成每1m1中含40mg的溶液，依法测定，比旋度为+102.5。至 +107.5。；维生素D3加无水乙醇溶解并定量稀释制成每1ml 中含5mg的溶液，依法测定，比旋度为十105。至+112。(二 者均应于容器开启后30min内取样，并在溶液配制后30min 内测定)。(三)其他鉴别方法维生素D2、D3可用薄层色谱法、HPLC法和制备衍生物测 熔点进行鉴别。此外，亦可通过其紫外、红外吸收光谱的 特征加以鉴别。(四)维生素D2、D3的区别反应取维生素D10mg，溶于96乙醇10ml中。取此液0.1m1，加乙醇1ml和85硫酸5ml。维生

14、素D2显红色，在570nm波长处有最大吸收；维生素D3显黄色，在495nm波长处有最大吸收。此反应也用于D2和D3的含量测定。(一)麦角甾醇的检查(二)前维生素D的光照产物三、杂质检查（略）(一)维生素D测定法（二）讨论四、含量测定（略）维生素D的含量测定方法各国药典各异。USP(24)关于维生素D的测定方法有化学法、色谱法和微生物法；BP(2000)有化学法、光谱法和色谱法；而中国药典采用正相高效液相色谱法测定。 维生素E（消旋-生育酚醋酸酯）苯并二氢吡喃醇第五节 维生素E的分析名 称R1R2相对活性-生育酚-生育酚 -生育酚 -生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1*生物效价右旋体 ： 消旋体 = 1.4 ：10（天然品） （合成品）dl生育酚醋酸酯（一）结构与性质苯环 + 二氢吡喃环 + 饱和烃链1、易溶于有机溶剂，不溶于水2、UV3、酯键 易水解1、硝酸反应7515橙红色（二）鉴别2、三氯化铁联吡啶反应O3、紫外光谱法4、薄层色谱法5、其他方法（三）杂质检查 1、酸度 2、生育酚 硫酸铈滴定液（0.01mol/L） 二苯胺（亮黄灰紫）（1）原理：利用游离生育酚的还原性，将硫酸铈还原成硫酸亚铈（2）试剂（四）含量测定1、GC法（1） GCGC特点特点选择性好 灵敏度高 速度快 分离效能好挥发性低、不稳定 、极性强衍生化 易受样品蒸气压