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1、第四章 蛋白质化学（Chemistry of Protein)1导 学l掌握蛋白质的分子组成与结构l熟悉蛋白质的理化；常用分离、纯化技术的 基本原理。l了解蛋白质分子结构与功能的关系；蛋白质 的分类以及重要的活性肽。2教学内容l 蛋白质的分子组成l 蛋白质的分子结构l 蛋白质的理化性质与分离纯化l蛋白质的分类3第一节 蛋白质的分子组成蛋白质含量蛋白质含量= =样品所含氮量样品所含氮量6.256.25一、蛋白质元素组成：蛋白质的特征元素，平均含量：蛋白质的特征元素，平均含量：16%16%CHON NS4二、蛋白质的基本组成单位氨基酸（一）氨基酸的结构一）氨基酸的结构共同结构共同结构5氨基酸结构特
2、点：l20种编码氨基酸l氨基酸的不同在于R侧链不同l均为L-氨基酸l（甘氨酸、脯氨酸除外）6（二）氨基酸的分类l非极性中性氨基酸l极性中性基氨基酸l极性酸性氨基酸l极性碱性氨基酸根据根据R R基极性大小分：基极性大小分：R基有极性， 但不带电， 呈亲水性R基无极性， 呈疏水性R基有极性， 电离后R基带 负电荷R基有极性， 电离后R基带 正电荷7非 极 性 中 性 氨 基 酸NHCH32CH28极 性 中 性 氨 基 酸Cys，9酸性氨基酸10碱性氨基酸H2N-C-NH=NH11（三）氨基酸的理化性质氨基酸具有氨基、羧基等能接受能接受HH+ +而成而成NHNH3 3+ +具碱性具碱性能电离出H+
3、而成COO- 具酸性1.两性电离和等电点12氨基酸的两性电离pHpHpIpI等电点：等电点： 氨基酸所带正负电荷相等时溶液的氨基酸所带正负电荷相等时溶液的pHpH （pIpI） 值即该值即该氨基酸的等电点氨基酸的等电点132.茚三酮反应 （蓝紫色）（蓝紫色）脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色化合物14三、肽 （一）肽的形成和命名 肽键的形成1. 1. 肽键肽键15肽键平面162.肽的形成与命名l肽、寡肽(oligopeptide)、多肽(polypeptide)l多肽链（polypeptide chain）l主链骨架（backbone）l侧链部分（side chain）l羧基末端或C-末端（
4、C-terminus）l氨基末端或N-末端（N-terminus）17多肽链的结构 侧链N-末端C-末端主链骨架HOH18（二）体内重要的肽 谷胱甘肽（GSH）的结构Glu-Cys-Gly 功能基：-SH 解毒剂、抗氧化剂19第二节 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构基本结构空间结构一级结构二级结构三级结构四级结构20一、一级结构l概念：多肽链中氨基酸的组成与排列顺序l主键：肽键l意义：决定蛋白质的空间结构21胰岛素的一级结构A链B链22二、二级结构 （secondary structure）l定义蛋白质分子中由于肽键平面的相对旋转，构成的局部空间构象。 23（一）二级结构的类型l-螺旋l-折叠
5、l-转角l无规则卷曲241.-螺旋（-helix） 右手螺旋右手螺旋 每周含每周含3.63.6个残基个残基 螺距螺距0.540.54nmnm 作用键：氢键作用键：氢键0.50nm0.54nm氢键-碳原子侧链252. -折叠 （-sheet）锯齿状锯齿状顺向平行顺向平行、逆向平行逆向平行作用键：作用键：氢键氢键平行俯视侧视反平行俯视侧视263.-转角（ -turn）274无规卷曲（random coil）l肽链的肽键平面不规则排列，形成松散的二级结构。28（二）超二级结构与结构域 超二级结构（super secondary structure）l二级结构单元进一步聚集和组合在一起 模序（moti
6、f）l如、等亮氨酸拉链和锌指结构29（二）超二级结构与结构域结构域（domain）l超二级结构的进一步组合、折叠形成的球状区域。l是蛋白质的功能部位30免疫球蛋白结构域 重链轻链结构域31三、三级结构 （tertiary structure）l定义：在二级结构基础上，所有原子（主链+侧链）相互作用形成的空间构象32三、三级结构 （tertiary structure）l化学键-氢键、疏水键、离子键、二硫键等次级键-亲水基团：分子表面；疏水基团：分子内部33三级结构示意图二硫键极性基团 离子键 34四、四级结构 （quaternary structre）定义：定义：两个或两个以上独立三级结构的多
7、肽链两个或两个以上独立三级结构的多肽链通过通过次级键次级键结合而形成的空间结构结合而形成的空间结构疏水键、氢键、盐键疏水键、氢键、盐键亚 基35血红蛋白四级结构示意图4个亚基构成2-亚基2-亚基36蛋白质一、二、三、四级结构示意图37五、维持蛋白质分子空间构象的主要化学键 l氢键、疏水键、离子键、范德华力、二硫键等38蛋白质分子中的主要次级键 离子键离子键 疏水键疏水键 二硫键二硫键氢 键 范德华力 39六、蛋白质结构与功能的关系l蛋白质的一级结构决定其高级结构l蛋白质的空间构象决定蛋白质的生物学功能。40（一）一级结构与功能的关系 l某些蛋白质的一级结构加工后，才具有生物学活性。l如胰岛素原
8、（proinsulin）的一级结构加工 41（一）一级结构与功能的关系l一级结构的改变可引起某些疾病的发生l由于蛋白质分子的变异或缺失而产生的疾病，称为分子病（molecular disease）。l如镰状红细胞性贫血 42（二）空间结构与功能的关系 l空间构象决定蛋白质功能l构象改变，功能改变43血红蛋白结合氧前后构象的变化 l 当血红蛋白结合氧以后，11与22两个二聚体彼此滑动15，其构象由T（tense）型转变为R（relaxed）型。Hb (T态)HbO2 (R态)11221544任何一个亚基接受氧分子后，会增进其它亚基吸附氧分子的能力环境氧浓度高时 Hb快速吸收氧分子环境氧浓度低时
9、Hb快速释出氧分子动脉静脉血红蛋白对氧的运输45第三节 蛋白质的理化性质与分离纯化 46一、蛋白质的理化性质（一）蛋白质的一般性质1.蛋白质的紫外吸收特征蛋白质（色氨酸、酪氨酸）（苯丙氨酸）=280nm =260nm紫外吸收（与蛋白质浓度成正比）47蛋白质的紫外吸收10,000100010010200 250 300 波长（nm）TrpPheTyr摩尔吸光度（M-1cm-1）482.蛋白质的两性电离和等电点 l与氨基酸的两性电离、等电点相同49l双缩脲反应：Cu2+蛋白质 紫色络合物OH-3.蛋白质的呈色反应 颜色反应颜色反应光吸收光吸收定量分析定量分析503.蛋白质的呈色反应 颜色反应颜色反
10、应光吸收光吸收定量分析定量分析l酚试剂反应：磷钨酸蛋白质 蓝色化合物磷钼酸51l米伦试剂反应：米伦试剂蛋白质 红色沉淀3.蛋白质的呈色反应 颜色反应颜色反应光吸收光吸收定量分析定量分析52l考马斯亮蓝反应：考马斯亮蓝蛋白质 （R-250）红蓝色（G-250）蓝绿色3.蛋白质的呈色反应 颜色反应颜色反应光吸收光吸收定量分析定量分析53（二）蛋白质的高分子性质 1.蛋白质的胶体性质l蛋白质分子的直径在胶体颗粒的范围(1100nm)l蛋白质溶液是稳定亲水胶体溶液l稳定因素：水化膜、同种电荷54碱 碱酸 酸 552.蛋白质的扩散与沉降l 蛋白质分子大，扩散速度慢l 沉降：通过超速离心克服布朗运动使蛋白
11、质颗粒下沉的现象 l 沉降系数（S）可粗略反映蛋白质分子大小563.蛋白质的变性与复性 变性剂变性剂蛋白质空间蛋白质空间 构象破坏构象破坏生物学活性丧失生物学活性丧失 理化性质改变理化性质改变加热、酸碱、有机溶剂、加热、酸碱、有机溶剂、 尿素、盐酸胍、去污剂尿素、盐酸胍、去污剂易水解易水解 易沉淀易沉淀蛋白质非共价键蛋白质非共价键 和二硫键破坏，和二硫键破坏， 不涉及肽键不涉及肽键57复性：去除变性因素，蛋白质恢复空间构象与生物学活性的过程3.蛋白质的变性与复性58核糖核酸酶的变性与复性示意图8M尿素或 -巯基乙醇透析59l某些蛋白质质在发发生热变热变 性后，松散的多肽链肽链 相互缠绕缠绕 在
12、一起，变变成固体状态态，称为为蛋白质质的凝固（coagulation）。 60二、蛋白质的分离纯化鉴定技术 蛋白质在细胞内常与核酸、多糖、脂类及其它小分子物质结合在一起，需要对其进行分离、纯化与鉴定。61（一）离心l原理：分子大小、密度不同沉降速度不同l分类：普通离心：310 kr/min高速离心：1025 kr/min超速离心：25 kr/minl常用S值表示蛋白质分子质量相对大小62（二）透析 (dialysis)l用透析袋（半透膜）把大分子和小分子分开的方法63（三）沉淀(precipitation)l定义：蛋白质分子相互聚集从溶液中析出的现 象l原理：破坏同种电荷和水化膜64（三）沉淀
13、(precipitation)l方法： 盐析法有机溶剂沉淀法重金属盐沉淀法生物碱试剂沉淀法651.盐析（salting out）法 l定义：高浓度中性盐使蛋白质从溶液中析出沉 淀的方法l原理：破坏水化膜、中和电荷l特点：蛋白质不变性l分段盐析：不同浓度的中性盐分离不同蛋白质662.有机溶剂沉淀蛋白质 l原理：破坏水化膜l条件：pH=pIl特点：常在低温下进行l常用有机溶剂：乙醇、丙酮等673.重金属盐沉淀蛋白质l原理：中和负电荷l条件：pHpIl特点：蛋白质变性684.生物碱试剂与某些酸类沉淀蛋白质l原理：中和正电荷l条件：pHpIl特点：蛋白质变性l常用酸类：苦味酸、鞣酸、钨酸、三氯醋酸、硝
14、酸、过氯酸等69（四）蛋白质层析 （chromatography）l定义：待分离的液体（流动相mobile phase ） 经过一个固态物质（固定相solid phase)后所发 生的各组分在两相中分布的变化。l原理：根据混合物溶液中蛋白质分子的大小、 形状、极性、亲和力等差异而加以分离。70l类型：离子交换层析（ion exchange chromatography）凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)亲和层析(affinity chromatography)（四）蛋白质层析 （chromatography）71（五）电泳 （electrophoresi
15、s）l定义：带电颗粒在电场中将向与自身电荷相反的电 极移动，从而到达分离的方法。72l常用的电电泳技术术：琼琼脂糖凝胶电电泳（agarose gel electrophoresis，AGE）聚丙烯酰烯酰 胺凝胶电电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）等电电聚焦电电泳（isoelectric focusing，IEF）双向电电泳（two dimensional electrophoresis，2DE）毛细细管电电泳（capillary electrophoresis，CE）（五）电泳 （electrophoresis）73（六）western blotting（蛋白印迹法，免 疫印迹法） 把电泳分离的蛋白组分转移到固定膜（ 如硝酸纤维素膜、
