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1、实 验 一 细菌的简单染色和革兰氏染色辽宁师范大学生物基础实验教学中心谢鲲鹏（一）实验目的：1、学习微生物涂片的基本技术 2、巩固显微镜的使用方法和无菌操作技术 3、掌握细菌的简单染色法和革兰氏染色法。（二）实验原理：1、简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的方 法。此法操作简便，适用菌体一般形态和细菌排列 的观察。 2、革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram氏 创立的。而后一些学者在此基础上作了某些改进。 革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。（三）实验器材1、菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。 2、染色剂：吕氏美蓝、结晶紫、碘液、95%酒精、番红。 3、仪器或其他用具：显微
2、镜、酒精灯、载玻片、接种杯、双层瓶、擦镜纸、吸水纸、废液缸、洗瓶等。（四）实验方法：1、简单染色： （1）涂片：取两块载玻片，各滴一小滴生理盐水于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从大肠杆菌和金黄色葡萄球菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。 （2）干燥：室温自然干燥。 （3）固定：涂面朝上，通过火焰2-3次。 （4）染色：将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上。 （5）水洗：倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。 （6）干燥：自然干燥，或用电吹风吹干，也可以用吸水纸吸干 。 （7）镜检：涂片干后镜检。2、革兰氏染色： （1）制片：取菌种培养物常规涂片，干燥，固定。 （2
3、）初染：滴加结晶紫染色1min，水洗。 （3）媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min ，水洗。 （4）脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜 ，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。 （5）复染：用番红复染约2min，水洗。 （6）镜检：干燥后用油镜观察。 （7）混合涂片染色（五）实验总结 1、实验结果简单染色革兰氏染色2、复习 （1）简单染色操作步骤 涂片干燥固定吕氏美蓝染色1-2分钟水洗干燥镜检 （2）革兰氏染色操作步骤制片初染（结晶紫）1min水洗媒染（碘液） 1min水洗脱色（95%乙醇至无色）20-30S水 洗复染（番红）2min水洗干燥
4、镜检3、注意事项（1）涂片不宜过厚，以免脱色不完全，造成假阳性。（2）乙醇脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可 被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性 菌也会被染成革兰氏阳性菌。（3）菌龄，应选择活跃生长期的幼培养物作革兰氏染 色。培养时间过长，或死亡及部分自溶，改变了细菌 CW的通透性，造成阳性菌的假阴性反应。（4）火焰固定不宜过热。（5）媒染剂的作用，是增加染料和细胞之间的亲和性 或吸附力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使 之不易脱落。4、思考题 （1）你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意那些环节？ （2）如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高，时间太长，又会怎么样呢？ （3）你认为那些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ （4）革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色 ？
