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1、大实验二 淀粉酶产生菌的紫外线诱变育种 1、掌握紫外线诱变育种的原理和方法步骤2、了解淀粉酶活力测定方法 实验目的要求实 验 原 理实 验 步 骤分三阶段进行:诱变处理观察诱变效应 、接种、培养 -淀粉酶活力 测定第一部分 诱变处理1） 制备菌（芽孢）悬液；2） 显微镜直接计数，调整细胞（芽孢）浓度至约108/ml/；3） 倒平板（牛肉膏蛋白胨；每组12套）；4） 紫外线处理（3ml，直径6cm平皿，15min）；5） 稀释（至105）；实验步骤 (continued)实验步骤 (continued)6) 涂平板（取后3个稀释度，每稀释度2皿，每皿加菌液 100ul）；注意： 4）6）在暗室红
2、灯下进行7) 培养：平板倒置装于遮光袋，放置于37培养48小时 ； 8) 采用5）6）步同样方法稀释未经照射的菌液，并涂 平板（6个），37培养48小时。两天后进行第二阶段工作实验步骤 (continued)第二部分： 观察诱变效应、接种、摇瓶培养 11）接种、培养：选取诱变组透明圈直径和菌落直径比值较大的菌落（菌 株）3个，分别接种牛肉膏蛋白胨液体培养基（每株接1瓶 ），37，160rpm，培养23天。 9）分别计数诱变组和对照组平板上菌落数，并计算致死率 ； 10）观察诱变效应：加入碘液，分别测量诱变组和对照组1020个菌落的透明 圈直径和菌落直径，并计算比值，求平均数；将诱变组和对 照组
3、数据作比较。实验步骤 (continued)第三部分 -淀粉酶活力测定（部颁标准） 1、原理-淀粉酶能将淀粉分子键的-1，4葡萄糖苷键任意切断 成长短不一的短链糊精，以及少量麦芽糖和葡萄糖，而使 淀粉对碘呈蓝紫色特异反应逐渐消失，以该颜色消失的速 度计算酶的活力。 实验步骤 (continued)2、试剂1、原碘液 称取碘5.5g，碘化钾11g，先用少量蒸馏水 使碘完全溶解后定容至250ml，贮存于棕色瓶中。2、稀碘液 取原碘液1ml，加入碘化钾10g，用蒸馏水溶解 定容至225ml，贮于棕色瓶中。3、2%可溶性淀粉 精确称取2g可溶性淀粉（以绝干计） ，然后用少量蒸馏水调匀，徐徐倾于煮沸的蒸
4、馏水中，加热 煮沸至透明为止，冷却定容至100ml。（注意：此溶液需当 天配置）实验步骤 (continued)4、0.02mol/L pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4H2O）4.52g和柠檬酸 (C6H8O7H2O)0.807g,用蒸馏水溶解定容至100ml，配好后 应以酸度计或精密试纸校正pH。5 5、标准终点色溶液标准终点色溶液A液：精确称取氯化钴（CoCl6H2O）4.02439g和重铬 酸钾（K2Cr2O7）0.04878g，以蒸馏水定容至50ml。B液：精确称取铬黑T（C20H12N2NaO7S）5mg,以蒸馏水溶 解定容至50ml 使用时取A液4
5、0ml于B液50ml混合。此混合液宜冰箱保存， 使用15天后需要重新配制。 实验步骤 (continued)3、操作步骤1) 发酵液经5000rpm离心10min，取上清，作 为供试酶液。2) 测定：A) 取2ml标准终点色溶液滴于白瓷板空穴内 ，作为比较颜色的标准。B）取10ml 2%可溶性淀粉和10ml pH6.0磷酸氢二钠- 柠檬酸缓冲液，放于大试管中，在60恒温水浴中预 热45min。然后加入酶液1ml，立即记录时间，充分 摇匀。定时用滴管取反应液约0.5ml，滴于预先充满 比色稀碘液(约1.5ml）的磁板空穴内，当穴内颜色反 应由紫色逐渐变为红棕色，与标准终点色相同时，即 为反应终点
6、，并记录时间t (min)。实验步骤 (continued)4、计算酶活酶活用1ml酶液于60，pH6.0的条件下，1h液化可 溶性淀粉的克数来表示g可溶性淀粉/mlh酶活力单位= 60/t102%实验步骤 (continued)实验结果 实验报告1、实验原理、方法步骤、结果及分析 2、思考题1） 为分离获得产蛋白酶的细菌，应从何种环 境取样？2）如要分离淀粉酶产生菌，应如何设计培养 基？怎样识别目标菌？从何种环境取样？准 备：（配方见第三部分）1）原碘液、稀碘液 （616-L1 & 616-R1）2）2%可溶性淀粉 (616-L2 & 616-R2)3）0.02mol/L pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 (619-L1 & 619-R1) 4）标准终点色溶液 (619-L2 & 619-R2)
