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1、第三章 临床酶学检验技术 1 1教学目标与要求掌握酶活性的国际单位定义；酶活性测定的连续监测法和定时 法的概念、区别和结果的计算方法；酶偶联反应的在酶活性测 定和酶法分析代谢物中的应用；以NAD（P）H为指示系统和色素 原底物在酶活性测定中的应用；酶活性测定最适条件的概念和 意义；酶试剂法分析代谢物中的平衡法和速率法原理和要求； 同工酶的概念；IFCC推荐法测定临床常用诊断酶的测定原理和 评价。 熟悉酶活性浓度和正常上限升高倍数的表示方法；酶活性测定 的各种影响因素；各种酶活性测定条件的确定原则；NAD（P）H 指示系统在酶法分析代谢物中的应用和该法的缺点，氧化酶系 统在酶法分析代谢物中的应用
2、和该法的缺点；免疫抑制法测定 同工酶的原理。 了解酶蛋白质量测定的优点；底物或产物浓度的检测手段；电 泳法测定同工酶的特点；定时法测定临床常用诊断酶的原理和 评价。2 2本章主要内容 第一节 酶含量的表示方法 第二节 酶催化活性的测定方法 第三节 酶活性测定的影响因素与最适条 件的确定 第四节 代谢物的酶法测定 第五节 同工酶检测技术 第六节 临床诊断中常用血清酶及其同工 酶 3 3概 述 一、历史 二、分类和命名 血浆特异酶 ：有一小部分酶在细胞内合成后分泌到血 液中，并行使一定功能 。凝血过程有关的酶、胆碱酯酶 （CHE）、铜氧化酶、脂蛋白脂酶 非血浆特异酶： 外分泌酶：-淀粉酶（AMY）
3、、脂肪酶（LPS）、胃蛋白酶原 ALP、酸性磷酸酶（ACP） 细胞内酶 4 4 三、作为诊断酶应具备的条件： 特异性：在组织、器官分布相对专一性 灵敏度：细胞内外酶浓度的差异 酶在细胞内定位与存在形式 酶蛋白分子量的大小 4.在血液中的半衰期 有理想的检测方法5 5 四、血清酶变化的病理生理机制 合成异常 诱导作用 清除减慢 血管内激活、抑制、聚合、失活、降解 细胞膜通透性改变： 分泌6 6 五、酶的性质和用途 酶含量在病理情况下发生改变：诊断酶 酶具有高效催化性和高度特异性 ：酶试 剂 酶作为催化剂，在反应前后无明显变化： 固相酶 大多数酶的化学本质是蛋白质：免疫学方 法测定酶质量 酶作为催
4、化剂：测定酶的催化活性 同工酶及其亚型：更高的组织特异性7 7第一节 酶含量的表示方法 一、酶的催化活性 （一）酶活性单位 （二）酶催化活性浓度 （三）正常上限（upper limits of normal,ULN）升高倍数 二、酶蛋白质量8 8一、酶的催化活性 （一）酶活性单位 惯用单位 国际单位 Katal单位 3类酶活性单位定义的不同主要是：采用 不同的时间单位和产物或底物量单位。 单位的定义原则是以酶促反应为依据， 人为地规定在一定条件下、一定时间内 的底物消耗量或产物生成量，即酶促反 应速度来表示酶活性。 9 9 国际单位： 在特定条件下，1分钟能转化1微摩尔底 物（mol/ min
5、）的酶量为一个国际单位 Katal单位：即每秒钟转化1个摩尔底物 （mol /s）的酶量。 国际单位和katal间关系如下： 1U1mol /min110-6 /60s 16.67nkatal1010（二）酶催化活性浓度 临床上测定的酶活性不是酶的绝对 量而是浓度，即单位体积体液中的 酶活性。国际单位中并未明确规定 用ml或L表示体积。目前在临床化学 中，几乎都习惯用U/L来表示体液中 酶活性即酶活性浓度。1111（三）正常上限升高倍数（upper limits of normal,ULN） 所谓正常上限升高倍数（ULN）是指用测得 的酶活性结果除以参考范围上限 。 酶催化活性或活性浓度是一个
6、相对的概念 ： 与测定方法有关 与测定条件有关 与原料质量和来源有关 假设酶在测定过程中保持不变1212二、酶蛋白质量与测定酶活性相比的优点： 1灵敏度高。灵敏度达到ng/至g/的水平 。 2特异性高。不象酶活性测定的影响因素那么 多，几乎不受体液中激活剂、抑制剂的影响，不 受药物的干扰。 3可测定一些酶活性很难测定的酶。如不表达 酶活性的酶原或脱辅基的酶蛋白或失活的酶蛋白 。 4 与酶活性测定一起，计算免疫比活性，有可 能为临床应用提供新的资料和信息。 5在同工酶测定中的应用。与电泳法和层析法 相比，免疫学法测定简单快速灵敏度高，标本量 少，重复性好。与化学抑制法相比特异性好。1313 与测
7、定酶活性相比的缺点： 由于制备具有高效价的酶抗体非常 困难，建立免疫学方法的周期和成 本都相当巨大。因此，目前能测定 的酶类还非常有限 。 而测定酶活性是通过测定底物消耗 量或产物生成量的手段，要容易的 多。时间足够长，底物消耗量或产 物生成量足够多，加上偶联酶的使 用可以测定任何酶。1414第二节 酶催化活性的测定方法 一、测定酶促反应速度的两类方法 （一） 定时法（Fixed time assay ） （二）连续监测法（Continuous monitoring assay） 二、 底物或产物浓度的检测 三、 酶活性测定方法原理 （一）直接法 （二 ）间接法 1515一、测定酶促反应速度的
8、两类方法 酶促反应速度可以用单位时间的底物消耗量（ -dS/min）或产物生成量（dP/min）来表 示。分类：一种直接用来测定速度的方法称为连续监 测 法（Continuous monitoring assay） 另一种在一定时间内通过测定总变化量再计 算出速度的方法称为定时法（Fixed time assay） 1616（一） 定时法（Fixed time assay） 1、定义： 将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等 ）下孵育，酶促反应开始进行，经过一定 时间后，用终止液终止反应，此时酶促反 应已经停止，底物和产物将不再变化，测 出底物或产物的总变化量，除以时间即可 计算出底物消耗速度（
9、-dS/min）或产 物生成速度（dP/min），将速度换算为 mol/ min便是以国际单位表示的酶活性 。 1717 2、计算18181919 定时法与终点法和两点法的区别： 终点法（end-point assay）是指反应基 本达到平衡，信号变化很小，但可以不需 要终止反应，例如化学反应或酶试剂测定 代谢物，只能说明反应所需的某一组分已 接近耗尽。而定时法的特点是经过一定时 间（固定的时间）反应后终止反应。 两点法（two-point assay）是监测反应 过程中的任何两个点，即某一段时间内的 底物或产物的变化。2020（二）连续监测法（Continuous monitoring as
10、say） 定义： 将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度 等）下孵育，每隔一定时间（2-60s） 连续测定酶促反应过程中某一底物或产 物的特征信号（如NADH在340nm的吸 光度）的变化，从而计算出每分钟的信 号变化速率。2121 2、酶促反应过程 一个典型的酶促反应过程一般包 括： 延滞期（lag phase） 线性期（linear phase） 非线性期（non linear phase）2222连 续 监 测 法 反 应 曲 线2323 1.延滞期：对单一酶促反应而言，是 指酶促反应开始到达到最大反应速度 所需要的时间，包括酶催化位点的暴 露、底物解离后与酶结合位点的结合 、酶与辅酶的结合
11、、酶的激活等等； 对于酶偶联反应而言，延滞期还包括 中间产物堆积到一定程度后，导致指 示反应速度增加，直到与待测酶酶促 反应速度达到平衡所需的时间。一般 来说，辅助酶越多，延滞期越长。2424 2.线性期：是指酶促反应速度保持恒定的 时期，不受底物浓度的影响。此期底物虽 被不断消耗但还不足以明显改变酶促反应 的速度，即以初速度进行。初速度是指底 物的消耗量小于5%时的速度。不过线性 期也仅仅是一个相对的概念，在实际工作 中往往需要人为地设定非线性度。 3.非线性期：随着反应的进行，底物消耗 越来越明显，反应速度明显下降而进入非 线性期。酶浓度越高在选定条件下，线性 期就越短。其他造成进入非线性
12、期的原因 有可逆反应增强、产物抑制增加、酶变性 失活增加、酶聚合或解离增加等等。 2525 3、计算26262727 连续监测法与定时法比较： 连续监测法需要连续监测，对仪器 要求较高，需要具有恒温装置和连 续记录吸光度装置。相反，定时法 对仪器要求不高，一般的分光光度 计就能满足要求。由于一般的光度 计所测得的摩尔消光系数与理论值 差别较大，在实际工作中常常需带 标准一起测定。2828 连续监测法根据连续测得的数据，可以只 选择线性期的底物或产物变化速率用于计 算酶活力。 而定时法测得的酶活性是酶 促反应的整个过程中的平均速度，有可能 包括延滞期和非线性期。由于酶活性只与 线性期的反应速度（
13、初速度）成正比例， 定时法很难避开延滞期，非线性期也不能 完全避开，因此连续监测法测定酶活性比 定时法更准确。 2929二 底物或产物浓度的检测 不管是定时法还是连续监测法，都要通过 测定底物或产物来实现。测定底物或产物 的手段并不是酶促反应所特有，根据在酶 促反应中任一底物或产物有特征性的物理 化学特性（如颜色、浊度、吸光度、pH、 气体、荧光、放射性等等），设计一些检 测装置。 常用的检测装置有比色计、浊度仪、分光 光度计、荧光分光光度计、量积仪、电位 滴定仪、生物传感器等，其中分光光度法 最常用 3030测定项目方法原理测定手段胆碱酯酶氯化乙酰胆碱做底物产 生乙酸根电位滴定法脂肪酶三油酸
14、甘油酯悬乳液做底物， 生成油酸甘油一酯，浊度下降浊度法淀粉酶淀粉做底物，一定时间后，剩 余的淀粉不足以使碘呈兰色时间滴定法丙氨酸氨基转移酶赖氏法比色法丙氨酸氨基转移酶IFCC推荐法分光光度法丙氨酸氨基转移酶固定化谷氨酸氧化酶膜生成过 氧化氢，利用过氧化氢电极生物传感器N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶4-甲基伞形酮N-乙酰-D -氨基葡萄糖苷做底物荧光葡萄糖6磷酸脱氢酶NADPH在365nm激 发下产生荧光荧光3131三 酶活性测定方法原理 （一） 直接法 是指待测酶酶促反应的底物或产物有特征性的理化性 质，然后通过特殊的仪器直接检测 （二 ）间接法 是指酶促反应底物和产物之间没有特征性的理化性 质，需
15、通过另一个化学反应或生化反应，将底物或产 物转化为有明显特征理化性质的另一个化合物。用直 接法来测定的酶类非常有限，很多情况下不得不使用 间接法。3232直接法的原理 基于NADH或NADPH的反应原理 ： 乳酸脱氢酶（LD）、葡萄糖6磷酸脱氢酶（G-6- PD）、-羟丁酸脱氢酶（-HBD）、醇脱氢酶 （AD）、山梨醇脱氢酶（SD）、谷氨酸脱氢酶 （GLD）等 基于人工合成色素原底物 ： 碱性磷酸酶（ALP） 、-谷氨酰转移酶（GGT） 、淀粉酶（AMS） 、-岩藻糖苷酶（AFU） 、 甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶（GPDA） 基于氧的消耗 ：各种氧化酶 其他 ：胆碱酯酶 （CHE）、脱羧酶 3333间接法的原理 .化学法 大多数定时法都是在酶促反应终止后 加入另一个试剂与底物或产物反应，转化为有色 化合物，再用分光光度法检测。也有个别酶类不 终止反应，加入与酶促反应无关的试剂，但能与 酶促反应的某一产物反应生成有特征性的化合物 。例如：(1)胆碱酯酶催化酰基硫代胆碱类底物后 ，生成的硫代胆碱（SCh）与5，5-二硫代-双
