植物组织培养 第六章 植物细胞培养

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1、第八章 植物细胞培养 （plant cell culture）本章内容提要：一、植物细胞培养概念及技术二、植物细胞生长和活力的测定三、植物细胞培养的应用四、人工种子 定义：在离体条件下，将愈伤组织或其他植物器 官易分散的组织置于液体培养基上进行振荡培养， 得到游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖， 从而获得大量细胞群（单细胞无性系）的一种技术 。 意义： 1、细胞生理代谢及其影响因素研究。 2、通过单细胞克隆化，结合遗传分子生物学，进 行农作物改良。 3、细胞增殖速度快，可用于次生代谢产物和药物 的生产研究。第一节 植物细胞培养概念一、植物细胞培养1、单细胞培养单细胞制备方法 机械法：叶肉组

2、织分离、吸涨的胚胎等。 酶法：利用专一的水解酶，在温和的条件下，释放 出细胞。 愈伤组织诱导法：由于愈伤组织之间的结构十分松 散，通过高频率振动或添加酶，可使细胞分离。 单细胞培养方法1）平板培养 2）看护培养 3）微室培养 4）条件培养基培养 等 1）平板培养（Plating technique ）是为了分离单细胞无性 系，并对不同的无性系进 行研究，揭示它们在生理 、生化和遗传上的差异而 设计的一种单细胞培养技 术。最早是由贝格曼（ Bergmann,1960）首创的。平板培养的操作技术：当含0.6琼脂的无菌培养基冷却到3035呈 融化状态时，把2ml浓缩的悬浮液接种进去，均匀 混合倒入9

3、cm的培养皿中，每培养皿10ml，培养皿 中培养基固化后用石蜡密封。 优点：单离的细胞在培养基中分布较均匀，也便 于定点观察。 缺点：通气不好。2）看护培养 （Nurse culture）也称纸筏营养技术 ，就是用一块愈伤组 织来看护单细胞使之 生长和增殖的方法， 称看护培养。最早是 由米尔（Muir 1954） 创立的。操作方法：在一个三角烧瓶中加入一定量的固体培养基 ，培养基上放一块几毫米的愈伤组织，在组织块 上再放一张预先已灭过菌的滤纸，第二天把单细 胞放在滤纸上培养。一个月以后单细胞可以长成 肉眼可见的细胞团，23个月后从滤纸上取出放 在新的培养基上直接培养。3）微室培养（Micro-

4、culture） 是为了进行单细胞活体连续观察 而建立的一种微量细胞培养技术 ； 最早是由德洛普（De Ropp 1955 ）发明的悬滴培养(Hanging- drop culture)演变而来的； 后来又发展成了多滴排列技术（ Potrykus 1979）和多室培养盘 (Muotidish,Wergicke 1979)。4）条件培养基培养（condition medium culture）在培养基中预先加入高密度的细胞进行培养，这些 细胞就会向培养基中分泌一些物质，使得利于单细 胞或低起始密度的细胞群体有利于培养。 条件培养基制作方法：把液体培养基培养了46周的高密度细胞滤掉， 然后将这些液

5、体制成液体或固体培养基，即为条件 培养基。 优点：明显提高单细胞培养的成活率和分裂能力 。兰花条件培养 2、细胞的悬浮培养1）定义：是将植物细胞和小的细胞聚集体悬浮在液体 培养基上进行培养，它们在培养过程中必须保持较好 的分散状态。细胞悬浮培养为植物细胞培养的工业化 生产开辟了新的途径。 优点：细胞均一、量大、增殖快速适宜于大规模培养 。 方法类型：分批培养 （一次性生产采收提取）半连续培养（每隔一定时间更换培养液）连续培养（封闭型与开放型） 小规模：利用培养瓶培养，震荡条件下； 大规模：利用生物反应器培养，提供可控制环境 条件，以满足细胞正常生长和生物合成的容器， 具有搅拌和通气装置，使物料

6、均匀混合，各组分 和热量在不同相际间传递。大规模培养包括：悬浮培养反应器固定化细胞反应器 细胞培养技术的优点(1)代谢产物的生产是在控制条件下进行的，因此可 以通过选择优良细胞系和优化培养条件等方法得 到超越整株植物产量的代谢产物。不仅节约能源 ，减少耕地占用面积，而且不受季节、地域的限 制。 (2)细胞培养是在无菌条件下进行的，因此可以排除 病菌和害虫的影响。 (3)可以通过特定的生物转化途径获得匀一的有效成 分。 (4)可以探索新的合成路线，获得新的有用物质。2）悬浮细胞的继代培养 每培养12周继代1次。 选择好接种时期（直线期 末） 控制起始接种量（0.52.5 105个/ ml） 注意

7、：继代时接种的规范 操作，以免被污染气声式 生物反 应器剪切式 生物反 应器气升式 生物反 应器 植物细胞的 生物反应器 大规模培养 1、细胞培养各时期特点： 延迟期(lag phase)细胞很少分裂或刚刚开始分裂。 对数生长期（logarithm phase ）细胞数目迅速增长， 直线生长期(linear phase)单位时间内细胞数目增长大 致恒定。 减缓期(retara phase)细胞数目的增长速率减缓。 静止期(stationary phase)细胞分裂停止，细胞数目恒 定。静止期初期是最佳的继代时间(计数、营养)。第二节 植物细胞生长和活力的测定2、细胞培养的同步化方法使细胞同步分

8、裂，提高有丝分裂指数(MI： 所观察的细胞总数中，正在进行有丝分裂的细 胞的百分率。物理方法 体积选择法、冷处理法。 化学方法： 饥饿法：控制营养液的供给 抑制法：添加化学抑制剂 有丝分裂抑制法：加入秋水仙素处理。3、影响细胞培养的因素 培养基 起始细胞密度和细细胞活力 生长调节剂 pH 和CO24、细胞低温保存法： 一般用5-100C，热带、亚热带植物用10-200C； 结合高渗可抑制外植体生长。方法简便，适于现 代种质库管理，材料恢复生长快。 (1) 低温保存：-200C。 (2) 超低温保存：5 单细胞培养的技术关键 细胞的起始密度测定：血球计数板 细胞密度：单位体积内的细胞数目。 起始

9、细胞密度：开始培养时，单位体积内的细 胞数目。在某一临界密度以下，细胞不能分裂 ，甚至很快解体。 不同培养方式要求不同： 悬浮培养：(0.5-2.5)105个/mL 平板培养：用植板率来衡量平板培养效果。 植板率 = 形成细胞团的数目/接种的总细胞数 100% 影响植板率的因素有：细细胞起始密度、细细胞 活力(对对数期)。胡萝卜悬 浮细胞培 养显微计 数 （1）再培养法即化冻后立即将材料转移到新鲜培养基 上进行再培养。 （2）荧光素双醋酸脂（FDA）染色法 （3）TTC法：此法显示细胞内脱氢酶的活 性。脱氢酶使TTC（氯化三苯四氮唑）还原 生成一种红色的物质，作为检验活细胞的 方法。 6、植物

10、细胞活力测定第三节、植物细胞培养的应用 1、概述 植物细胞含有人类所需的成分。 离体培养的植物细胞具有合成并积累次生代谢产物的潜力。 利用细胞培养技术生产植物产品已成为工业化生产植物产品 的一条有效途径。可以作药物，又可作为工、农、食品添加 剂等的原料。 存在的主要问题是：代谢产品的含量低，由此造成成本和产 品价格高。 植物细胞培养技术的发展，新型生长反应器的问世，资源的 短缺，使人为条件下大规模培养植物细胞具有极大的经济吸 引力。2、发展史 1956年尼克尔(Nickell)和鲁蒂恩(Routin)第一个申 请用植物细胞培养生产化学物质的专利。使生生代 谢产物成为可能，并进一步得到很大发展。

11、 1968年，日本明治制药公司已成功实现人参细胞的 发酵罐生产。 目前，已生产出过去只能从植物中提取的一系列产 品，如：重要药用植物的有效成分，香料、调味品 ，蛋白酶抑制剂，肿瘤抑制剂，色素等。3、应用举例（1）、生物碱：许多生产碱已用作药物，如小檗碱(胃 病等消化道疾病)，吗啡(神经麻醉剂)，喜树碱（抗 肿瘤），长春花生物碱种类多（已有66种），其中长 春碱(VLB)、长春新碱(VCR)等，具有抗癌效应。 罂粟种子的愈伤组织培养，提取各种生物碱。 已从喜树碱愈伤组织中分离得到喜树碱结晶，但含量 很低，仅为原植物的1/20。 长春花生物碱难以大量取得，因此研究用愈伤组织来 生产长春花生物碱是具

12、有重要的实用价值的，但目前 尚未从愈伤组织培养中获得。(2) 苷类物质： 含苷类药用植物的离体培养研究较多，其中含皂苷 的组织培养是最成功的。如薯蓣皂元是生产甾类避 孕药的重要原料。 用三角叶薯蓣的悬浮培养物及愈伤组织生产薯蓣皂 苷元，含量可达干重的2.6%。 人参组织培养是较成功的研究，人参的冠瘿细胞、 愈伤组织和再分化根在琼脂基和液体培养中培养数 周，所含以干重为基础的粗人参皂苷的含量分别为 21%、19.3%、27.4%，而天然人参中含量仅为4.1%。 现在人参皂苷的生产已进入工业化生产阶段。(3) 醌类物质：蒽醌、萘醌、泛醌等均是抗菌素类物质。 采用海巴戟的悬浮培养细胞可得总蒽醌含量占

13、干 重18%以上。 用决明的愈伤组织培养比原植物的种子蒽醌量高 10倍，约为干重的6%。从紫草的悬浮培养细胞 中萘醌含量比的原植物提高8倍，约为干重的 12%。现在已采用紫草、海巴戟等愈伤组织或悬 浮细胞，生产具有抗细菌活性的醌类物质。(4) 蛋白质类 A、酶制剂： 菜豆悬浮细胞培养液中，有过氧化物酶等多种酶类物质， 其培养细胞的过氧化物酶活性为根活性的9倍。试验表明 ：添加2，4-D、烟酸、肌醇、水解酪蛋白，可以维持菜豆 细胞的迅速生长。因此利用细胞培养生产酶制剂是非常有 希望的一种途径。 B、胰岛素： 从植物细胞培养物中提取胰岛系，已在苦瓜离体培养中获 得成功，采用苦瓜的离体培养物，提取胰

14、岛素的含量，净 重为1.9%，比原植物含量1.0为%提高近一倍。 C 、氨基酸： 自从发现3，4-二羟其苯丙氨酸(L-多巴)对治疗震颤 性麻痹症有效以来，人们从植物离体培养中，已得 到非常高比率的L-多巴。培养细胞生长速度快，而 且L-多巴主要积累在培养基，这有利于细胞连续培 养。 Tanaka等(1974年)报道，从聚合草的悬浮培养物 中，获得了L-谷氨酰胺，而且在愈伤组织中的含量 比完整植物叶子高260倍。(5) 食品添加剂 A、色素：红色素甜菜苷是一种糖苷，可用于食 物着色，从甜菜和菠菜培养物可以产生甜菜苷。 葡萄细胞培养可以生产花青素及苷色素。单冠毛 菊的愈伤组织培养可得到红色的花色素

15、。 B、 芳香油：一般认为芳香油是在植物的特殊 结构中合成。从黄菊的愈伤组织中得到芳香油； C、调味剂：从甜菊的愈伤组织和悬浮细胞培养中 ，可提取甜味剂。还可从长春花的细胞培养中，生产 磷酸二酯酶，作为调味品用。 D、 香精：从鸡冠紫苏的培养细胞合成的香精油， 主要成分为烯、2-蒎烯和沉香醇。 (6)农药 从除虫菊的愈伤组织可以生产除虫菊酯，除虫菊酯是 一种特别有效的杀虫剂。虽然人工也可以合成它，但 是昆虫对人工合成的拟除虫菊酯的抗性会加强。第四节 人工种子一 概念与意义 又称人造种子，这是细胞工程中最年轻的一项新 兴技术。最初是由英国科学家于1978年提出的。 人工种子是有体细胞胚、人工胚乳

16、和人工种皮三 个部分组成（体细胞胚是制作人工种子的起始材 料 ，目前已知能产生体细胞胚的植物只有200余 种） 充分利用了快繁技术的优势，又吸收了对植物生 长发育和农业生物技术研究的先进成果，人工种 子技术确实有着诱人的前景。芹菜人工种子 人工种子模式图二、人工种子具有以下优点： 1）繁殖速度快。人工种子中的体细胞胚是通过组 织培养法生产的，故能以很快的速度繁殖生产体 细胞胚。人工种子的包裹层是通过化学方法生产 的，不存在生物生产的任何限制； 2）可望获得整齐一致的植物苗。利于农业生产的 规范化、标准化和机械化管理，不存在任何遗传 变异问题； 3）缩短育种周期、加速良种繁育速度； 4）具备天然