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1、实验九，十实验九，十大肠杆菌感受态细胞的大肠杆菌感受态细胞的 制备和转化制备和转化分 子 生 物 学2008实 验2 0 1 0在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移 到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种 转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另 一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌， 需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后， 细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的细胞，称感受态细胞。一. 实验原理1. 概念感 受 态 细 胞分 子 生 物 学2008实 验2 0 1 0转化(Transformation)是
2、将外源DNA分子引入 受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它 是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域 的基本实验技术。 转 化分 子 生 物 学2008实 验2 0 1 0 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异 株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体,它可以容忍外 源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。 受体细胞经过一些特殊方法(如物理制备法,化学制备法等) 的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许 外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。 进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的 转移,使受体细胞出现新的遗传性状
3、。 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转 化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。转 化转化过程分 子 生 物 学2008实 验2 0 1 0KCl法， CaCl2法，电击感受态制备等 RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高， 但制备较复杂，不适合实验室用 电击感受态细胞转化效率高，操作简便，但需电 击仪 CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足 一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用 时，可加入占总体积15的无菌甘油于-70以下 保存半年，因此CaCl2法使用更为广泛.常用的感受态细胞制备方法分 子 生 物 学2008实 验2 0
4、1 0CaCl2法是以Mendel和Higa（1970）的发现，其 基本原理是：细胞处于 0 4 ， CaCl2 低渗溶液 中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于 细胞表面，经 42 90 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温 一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如 卡那霉素耐药基因得到表达，然后将此细菌培养物 涂在含卡那霉素的选择性培养基上，倒置培养过夜 ，即可获得细菌菌落。 CaCl 2 法制备感受态细胞原理分 子 生 物 学2008实 验2 0 1 0提高转化效率的几个因素 细胞生长
5、状态和密度 质粒的质量和浓度 试剂的质量 防止杂菌和杂DNA的污染分 子 生 物 学2008实 验2 0 1 0 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从 70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感 受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期 时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5菌 株的OD600 为0.5时,细胞密度在5107 个/ml左右(不 同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或 不足均会影响转化效率。 提高转化效率的几个因素分 子 生 物 学2008实 验2 0 1 0 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA主要是超螺旋态DNA
6、(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。提高转化效率的几个因素分 子 生 物 学2008实 验2 0 1 0 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的,并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污
7、染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 提高转化效率的几个因素分 子 生 物 学2008实 验2 0 1 01）材料E. coli DH5菌株； 质粒、 1.5ml 离心管（又称eppendorf管） 卡那霉素；2）设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，超 净工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度 计，微量移液枪， eppendorf管等。 二. 材料，设备及试剂分 子 生 物 学2008实 验2 0 1 0 0.1mol/L的CaCl2 LB液体培养基 LB固体培养基 Kana母液：卡那霉素(Kanamycin )母液：配成 10
8、0mg/ml水溶液, -20保存备用 3. 试 剂分 子 生 物 学2008实 验2 0 1 0三. 操作步骤 本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与质粒共保温,实现转化。由于质粒带有卡那霉素抗性基因，可通过卡那霉素抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入质粒，则在含卡那霉素的培养基上不能生长。能在卡那霉素培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了质粒。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。 分 子 生 物 学2008实 验2 0 1 01.受体菌的培养 1) 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5单菌落,接种于
9、3-5ml LB液体培养基中,37,180rpm振荡培养过夜；2) 将该菌悬液以1:30-100的比例接种于100ml LB液体培养基中，37振荡培养23小时至OD600在0.3-0.4左右 ;3) 无菌条件下取1.5 ml菌液到eppendorf管中，冰浴10min，4, 8000rpm离心5min;4) 彻底弃上清液，在冰浴上加入500ul预冷的无菌CaCl2 (0.lmol/L)使细胞悬浮；分 子 生 物 学2008实 验2 0 1 05) 4 ,8000 rpm离心4min，弃上清液;6) 用100l预冷的无菌CaC12 (0.lmol/L) 重新悬浮细胞，冰上备用；分 子 生 物 学
10、2008实 验2 0 1 02. 转化 取50l感受态细胞悬液，在冰浴中使其解冻，加入10l连接产物（或质粒DNA）(含量不超过50ng,体积不超过10l)，轻轻摇匀，冰上30-40min；A.质粒DNA组：10l 质粒DNA +50l感受态细胞悬液B.空白对照组:10ul 无菌水50l感受态细胞悬液分 子 生 物 学2008实 验2 0 1 0 42水浴中热击90秒（勿摇动），热击后 迅速置于冰上冷却2min； 向管中加入400l LB液体培养基(不含卡那 霉素)，混匀后37，180rpm振荡培养 40min，使细菌恢复正常生长状态，并表达 质粒编码的抗生素抗性基因(卡那霉素 )； 涂平板：
11、将上述菌液摇匀后取80ul涂布于含 Kana的筛选平板上，在菌液完全被培养基 吸收后，37倒置培养皿培养1218h。 分 子 生 物 学2008实 验2 0 1 0注意：1、含卡那霉素的LB固体培养基的配制:将灭菌的 LB固体培养基水浴溶解后冷却至60左右,加入Kana储存液,使终浓度为50-100ug/ml,摇匀后到平板；2、1小时空间：转化后温浴45min左右，让抗性基 因得以表达，再涂抗性平板分 子 生 物 学2008实 验2 0 1 0分 子 生 物 学2008实 验2 0 1 01. 1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质量感受态细胞有何特点？如何保证它的质量 ？2. 2.如阴性对照中长出菌，原因？如阴性对照中长出菌，原因？3. 3.还有哪些方法可以将外源基因导入受体细还有哪些方法可以将外源基因导入受体细 胞？各有什么优缺点？胞？各有什么优缺点？四. 问题与讨论
