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1、 结直肠癌c-erbB-2、CD44v6 及nm23表达与临床病理特征及预后的相关性研究硕士研究生 张 建 兵导 师 陈莉教授 肿瘤的复发和转移是当今肿瘤治疗最棘手的问 题之一。据统计，有90%以上的癌症病人死于肿瘤 的复发或转移。研究肿瘤细胞转移的分子基础及其 与癌基因及抑癌基因的关系，已成为目前肿瘤防治 研究的热点问题。真核细胞增殖调控是一个多因素 、多环节、涉及到细胞内众多分子事件的复杂过程 。在细胞增殖调控中，大多数癌基因是促进与发挥 正调作用，而抑癌基因则是抑制与负调作用。它们 在正常细胞中可能有调节细胞正常生长、抑制肿瘤 形成的作用，它们的失活或缺失会导致细胞增殖失 控或癌变。癌基
2、因c-erbB-2又称为neu 或 HER-2。c -erbB-2编码分子量为185ku 的穿膜蛋白，与 表皮生长因子受体（EGFR）同源，该蛋白可 以抑制酪氨酸激酶活性，c-erbB-2过度表达和 扩增可见于多种肿瘤。已有很多研究表明， 乳腺癌c-erbB-2的高水平表达常常与较大的原 发瘤体积、较多的腋下淋巴结转移及较差的 内分泌治疗反应性有关，预示着更早、更多 的术后复发及较短的生存期1，2。粘附分子CD44是淋巴细胞的一种归巢受 体，为高度异质性的单链跨膜糖蛋白，参与 细胞与细胞间、细胞与基质间的粘连，有标 准型（CD44s）和变异型（CD44V）两型。 据报道，其变异体CD44v6
3、过表达与结直肠 癌的侵袭能力有关3，4。核苷二磷酸激酶（NDPK/ nm23）属NME基 因家族，被认为参与了同恶性肿瘤转移相关的多种 调节活动。nm23异常改变一方面可引起微管聚合 而成的纺锤体异常，导致非整倍体形成；另一方面 可通过细胞骨架及细胞素等信号反应性的改变引起 细胞运动，从而参与侵袭和转移过程。研究发现啮 齿动物实验性肿瘤的转移能力与nm23基因的表达 呈密切负相关5，Bertheau 等6在甲状腺恶性 肿瘤中研究证实nm23及基因产物的表达与肿瘤的 转移和预后相关密集，nm23的mRNA 下调与肿瘤 的淋巴结转移和低生存率有关。结直肠癌（colorectal carcinoma
4、）是 人类常见恶性肿瘤之一，对人类的健康构成了极大 威胁。近年来对结直肠癌相关基因产物的检测已逐 步和早期诊断、发病机制、病理特征、估计预后等 密切联系起来，但研究结果不尽一致7-10。目前分 子病理学研究认为，结直肠癌的发生是个多阶段、 多因素作用的过程，主要是由于癌基因激活、抑癌 基因及DNA修复基因突变或功能缺失所致。我们 应用免疫组织化学方法同时检测结直肠癌中癌基因 蛋白c-erbB-2、CD44v6及nm23的表达，并探讨其 与病理特征和临床预后的相关性。1.1材料 1.1.1临床资料：92例结直肠癌：28例：有十年以上随访结果64例：无随访结果 以上病例均为结直肠原发性腺癌，不含腺
5、瘤癌变 的病例，都只作了结直肠癌根治手术，未作化疗、 放疗等辅助治疗。男性49例，女性43例，年龄24 75岁（中位55岁）。结肠癌27例，直肠癌65例。根 据国际抗癌联盟（UICC）的TNM分期标准11（见 表1）作临床分期：期19例，期28例，期37 例，期8例。表1 UICC结直肠癌TNM分期标准 A. T TNM定义 分期 描述 原发肿瘤（T） Tx 原发肿瘤资料不详T0 原发灶不能确定Tis 原位癌T1 肿瘤侵入粘膜下层T2 肿瘤侵入肌层. T3 肿瘤穿过肌层到浆膜 下或至无腹膜的结肠周围或直肠周围组织T4 肿瘤穿过脏层腹膜或 直接侵入其它器官组织表1 UICC结直肠癌分期 A. T
6、N NM定义 分期 描述 区域淋巴结（N）Nx 区域淋巴结资料不详No 无淋巴结转移N1 肿瘤转移至13个结肠（ 直肠）周围淋巴结 N2 肿瘤转移至4个结肠（直 肠）周围淋巴结N3 肿瘤转移至主要血管沿途 的任何淋巴结表1 UICC结直肠癌分期 A. TNMM定义 分期 描述 远处转移（M） Mx 不能确定有无转移M0 无远处转移M1 有远处转移 表1 UICC结直肠癌分期 B. 分期标准 期别 T N M0 Tis N0 M0 T1 ,T2 N0 M0 T3,T4 0 0 ny 1,2,3 0 ny ny 1 1.1.2病理资料： 92例结直肠癌中，高分化腺癌16例，中 分化腺癌45例，低分
7、化腺癌21例，粘液 腺癌10例。对全部病例观察了镜下肿瘤 生长方式（推进式为主34例，图1；浸润 性为主58例，图2）以及瘤周淋巴样细胞 聚集情况（21例见有大量淋巴样细胞浸 润，图3；71例无大量淋巴样细胞浸润， 图2）。 1.1.3主要试剂及实验材料：c-erbB-2 单克隆抗体（克隆系 TAB250），工作浓度1：100；CD44v6单 克隆抗体（克隆系2F10）, 工作浓度1： 100；nm23单克隆抗体（克隆系M-0421 ），工作浓度1：80。抗原修复液为 0.01M、PH6.0 枸橼酸盐缓冲液，DAB显 色。以上试剂、二抗及SP试剂盒均为 DAKO公司产品。免疫标记阳性对照组 织
8、来自乳腺癌、胃癌。1.2 方法1. 2.1 标本及玻片的处理： 所有标本经10%中性甲醛固定，石蜡包 埋，34m连续切片。每例选取四张切 片贴于经多聚赖氨酸处理的玻片上，70 oC烘烤2小时，1张进行HE染色，其余3张进行免疫组织化学染色。1.2.2 HE染色： 主要步骤：石蜡切片 脱蜡 梯度乙醇水化 苏木素染色 盐酸乙醇分化 返蓝 伊红染色 梯度乙醇脱水透明 封固 1.2.3 c-erbB-2、CD44v6及 nm23免 疫组织化学染色： 主要步骤： 石腊切片脱蜡至水 去内源性酶 抗原修复（高压锅煮沸放气3分钟,nm23 不需） 一抗 二抗 SP复合 物 DAB显色 水洗，苏木素复 染，封片
9、。 1.1.2.4 免疫组织化学检测结果分析方法 ：c-erbB-2、CD44v6 阳性定位在细胞膜 出现棕黄色颗粒，nm23阳性定位在细胞 浆出现棕黄色颗粒。着色细胞10%为 阴性，10%为阳性。1.2.5 统计学处理方法： 运用Stata 7.0统计软件（美国计算 机资源中心研制）进行统计学处理 。不同组间表达率的比较采用Fisher 精确检验；对有随访结果的病例用 Cox比例风险模型进行单因素和多因 素生存分析，并对有预后意义的指 标作出Kaplan-Meier生存曲线。2.1 结直肠癌癌基因蛋白表达与临床病 理参数的关系92例结直肠癌中，44例c-erbB-2阳性 （图4、5），阳性率
10、47.8%；51例 CD44v6阳性（图6、7），阳性率55.4% ；39例nm23阳性（图8、9），阳性率 42.4%。c-erbB-2、CD44v6及nm23表达 与组织分型、UICC分期、肿瘤生长方式 及瘤周淋巴样细胞浸润的关系见表2。 表2 C-erbB-2、CD44v6、nm23表达 与结直肠癌临床病理参数的关系 N C-erbB-2 阴性 阳性 阳性率% 组织类型 高分化腺癌 16 10 6 37.5 中分化腺癌 45 23 22 48.9 低分化腺癌 21 9 12 57.1 粘液腺癌 10 6 4 40.0 p=0.658 表2 C-erbB-2、CD44v6、nm23表达 与
11、结直肠癌临床病理参数的关系 N CD44V6 阴性 阳性 阳性率% 组织类型 高分化腺癌 16 8 8 50.0 中分化腺癌 45 21 24 53.3 低分化腺癌 21 7 14 66.7 粘液腺癌 10 5 5 50.0 p=0.696 表2 C-erbB-2、CD44v6、nm23表达 与结直肠癌临床病理参数的关系 N nm23 阴性 阳性 阳性率% 组织类型 高分化腺癌 16 9 7 43.8 中分化腺癌 45 27 18 40.0 低分化腺癌 21 13 8 38.1 粘液腺癌 10 4 6 60.0 p=0.690 表2 C-erbB-2、CD44v6、nm23表达 与结直肠癌临床病理参数的关系 N C-erbB-2 阴性 阳性 阳性率% UICC分期 、期 47 31 16 34.0 期 37 15 22 59.5 期 8 2 6 75.0 p=0.018*表2 C-erbB-2、CD44
