江苏省寄生虫病防治研究所 顾亚萍疟原虫镜检技术l疟原虫的基本形态特征l血片制作与染色l疟原虫计数l显微镜的维护与保养疟疾是由蚊子传播的寄生虫病，它的病原 体是疟原虫寄生于人体的疟原虫有4 种疟原虫基本结构n疟原虫基本构造为核、细胞质（胞浆）和疟 色素n原虫经姬氏Giemsa或瑞氏Wright染色：核呈红色,胞质呈兰色，疟色素为本色胞浆疟色素核1.1.核核 呈鲜红色，呈圆形或椭圆形核的结构呈鲜红色，呈圆形或椭圆形核的结构 致密，只有在个别发育阶段较为疏松，例如致密，只有在个别发育阶段较为疏松，例如 间日疟原虫雄配子体的核间日疟原虫雄配子体的核疟原虫基本结构2.细胞浆 蓝色或深蓝色，随着虫体发育长大 ，细胞浆逐渐增多疟原虫基本结构胞浆疟原虫基本结构n不着色，颜色和颗粒的形状，因疟原虫种类而 异，疟色素在虫体内散在分布或聚集成团块n间日疟原虫－－呈短棒状，黄褐色；n恶性疟原虫－－呈细砂状，黑褐色；n三日疟原虫－－呈砂粒状，深褐色；n卵形疟原虫－－与间日疟原虫相似3.疟色素疟色素滋养体期： 早期、晚期滋养体裂殖体期： 未成熟、成熟裂殖体配子体期： 雌、雄配子体疟原虫在RBC内各期形态各不相同疟原虫在红细胞内按照生长发育繁殖的阶段不同疟原虫基本结构1.红细胞不涨大 2.1个RBC内2个以上原虫 常见，环状体内可有2 个核 3.环状体可贴在红细胞 边缘 4.血片中除R、G外没有 其他发育期 5.配子体呈新月形或腊 肠形 6.成熟裂殖体约含16-32 个裂殖子，排列不规 则 7.可出现茂氏点恶性疟（P.falciparum） 鉴定要点1.红细胞通常涨大 2.薛氏点明显 3.环状体较粗大4.滋养体胞浆有阿米巴样 伪足5.血片中可见各期的原虫 形态6.成熟裂殖体约含12-24 个裂殖子，排列不规则间日疟（P. vivax ） 鉴定要点1.红细胞不涨大或略 小2.环状体中等大小， 核较大，胞浆粗厚3.胞浆不活跃呈带状 形 4.成熟裂殖体呈菊花 状,内含6-12个裂殖 子 5. 雌雄配子体小于正 常 红细胞，疟色素呈深褐色6. 常可查见各阶段 的疟原虫三日疟（P.malariae） 诊断要点卵形疟（P. ovale） 诊断要点1.红细胞略涨大或正 常，卵圆形或边缘 呈锯齿状2.环状体中等大小， 核较大，胞浆粗厚3.薛氏点出现较早粗 大，量多4.成熟裂殖体约含6-12个裂殖子5. 常可查见各阶段的 疟原虫被寄生的红细胞 间日疟原虫 大小斑点胀大 滋养体期开始 出现薛氏点 (Schuffner‘s dots )，出现 稍晚，鲜红色 ，细小数多恶性疟原虫 正常或略缩小常见有茂氏点 (Maurer‘s dots) ，紫褐 色，粗大数少 三日疟原虫正常或缩小常见有齐氏点 (Ziemann‘s dots )，淡红 色，微细卵形疟原虫略大或正常 感染红细胞 边缘呈距齿 状 常见有薛氏 点,出现较早 ，环状体阶 段可见， 红色，微粗疟原虫基本结构寄生的红细胞: 经染色后，因细胞内血红蛋 白溶解，轮廓消失，但有时尚留下残骸的“影 子”或点彩。
厚血膜由于用血量多，血膜小，细胞重迭， 干燥缓慢，各期疟原虫的体积都略为缩小，其 中大、小滋养体的形态有较大改变，裂殖体和 配子体的形态则变化不大厚血膜中疟原虫的形态：厚血膜恶性疟原虫厚血膜RingsGametocytes间日疟原虫厚血膜环状体配子体滋养体裂殖体由于在血膜制备过程中红细胞溶解，因而其 原形态消失，且染液和玻片上可能存在杂质 等，要根据疟原虫的三个基本要素仔细 加以鉴别n（1)疑似疟色素n（2）疑似疟原虫核n（3）疑似疟原虫胞浆疟原虫与其他异物的鉴别（4）血液成份与分析 （5）杂质---类似疟原虫的物质 （6） 形态失常疟原虫成份丢失成份增加形态改变药物影响血片的制作与染色n载玻片的清洗：n新玻片的清洗方法 用加有洗洁精或洗 衣粉的热水洗涤，浸于95% 的乙醇中1 小时以上n已用过的玻片：用加有洗衣粉的热水洗 涤，浸于95% 的乙醇中1小时以上载玻片每张载玻片上分别做1个薄血膜，1个厚血 膜标准血膜的位置如下图所示血片制作取血液4-5μl血滴置于载片的中央偏右1/3，由里向外划圈涂成直径为0.8-1厘米厚薄均匀、圆形厚血膜.血片制作厚血膜的涂制：标准的推片姿势薄血膜的涂制： 取血液1-1.5μl 血滴置于载玻片的中央， 将推片的一端置于血滴之前，当血液在载玻 片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，两 玻片保持20-30°角， 推成舌状薄血膜，长约2-2.5CM。
血片制作血片染色两种染色方法:n吉氏染色法n瑞氏染色法n常用吉氏染色法血片的染色n待血片完全干燥后才可染色n1．血膜的固定--甲醇吉氏染液：染色方法薄血膜经甲醇固定干燥后，用PH7.0-7.2 的磷酸缓冲液或蒸馏水将吉氏原液稀释 ，原液与缓冲液为1:20混匀染色20-30分钟，晾干镜检厚血膜溶血染色放置多时未染色的血片（2天以上，薄 片已用甲醇固定），在染色之前，须在 厚血膜上用清水进行溶血，待血膜全部 溶解后倒掉，用吉氏染液染色,清水漂 洗干净,晾干n 染色用水和冲洗用水npH7.0～pH7.2缓冲蒸馏水效果最佳n先制备好两种贮备液n贮备液I 1/15M磷酸氢二钠（Na2HPO4）溶液 n Na2HPO4 9.5 gn 蒸馏水 1000 mln贮备液Ⅱ 1/15M磷酸二氢钾 （KH2PO4 ）溶液 n KH2PO4 9.07 gn 蒸馏水 1000 mln缓冲蒸馏水配制nPH M/15 Na2HPO4 M/15 KH2PO4 DW n (ml) ( ml) (ml)n7.0 63 37 900n7.1 68 32 900n7.2 73 27 900n缓冲蒸馏水宜用时新鲜配制为好。
血片制作注意事项（1）在制作血片前，首先要核对患者的姓名、年龄和住址 （2）载玻片必须清洁无油污，理想的薄血膜是一层血细胞均匀分布不重叠和空泡，血膜末端呈舌状3）厚血膜厚度以一个油镜视野内可见5- 10个白细胞为宜4）制成的血片在未干前不能倾斜放置， 待其自然干燥，不要加热，加热会使原虫 变形，影响镜检结果．血片制作注意事项（1）染料溶剂的质量 （2）染液的新旧（3）染液稀释后使用时间原液必须临用时稀释，随配随用4）染液的稀释浓度（5）染色时间(6) 染色稀释用水:Ph7.0-7.2染色质量影响因素n（7）血膜在制备后应尽量能在当天染 色，一般夏天不超过48小时，冬天也 不能超过72小时n新制血片染色时厚血膜无需溶血n放置多时的血片，在染色之前先用清 水滴加在厚血膜上进行溶血.疟原虫密度计算疟原虫密度计算计算疟原虫密度的三种方法：● 白细胞原虫密度计数法 (厚血膜 WHO) ● 半定量计数法 (厚血膜) ● 红细胞感染密度计算法(薄血膜)白细胞原虫密度计数法n镜检厚血膜，按视野顺序，记录200个白细胞中的 疟原虫数，如果原虫密度较低，可增加白细胞，计 数500-1000 个n密度单位:原虫数/μln计算公式：疟原虫数 ÷ 计数的白细胞数 × 患者 每微升血白细胞数 = 疟原虫数/μl血。
n如果不知患者的白细胞数，则每微升血以8000个白 细胞计数(国际标准) 疟原虫密度计算厚血膜的疟原虫计数n从血膜的左上角开始，横向n计数1个视野后，每次间隔5个视野,再计数厚血膜疟原虫密度计算用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略地估 计出疟原虫密度这种方法简便，缺点是计数的疟原虫 数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定量分析 此方法将密度分为6级： 1.全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，记录实际数字 2.全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视野 不到1个虫，记录“少” 3.平均每个视野1-5个虫，记录“＋” 4.平均每个视野6-10个虫，记录“++” 5. 平均每个视野11-100个虫，记录“+++ ” 6. 平均每个视野100个虫以上，记录“++++ ” 如：Pv R+T++G少半定量计数法疟原虫密度计算红细胞疟原虫密度按以下公式计算： 1.红细胞疟原虫感染率（%）计算 红细胞原虫感染率（%）= 疟原虫数 ÷计数 的红细胞数X 100 2.红细胞疟原虫感染密度计算红细胞疟原虫密度=红细胞原虫感染率X红细胞 数/每微升血（男性500万个/μl；女性450万个/μl）红细胞疟原虫感染密度计算（薄血膜）疟原虫密度计算显微镜的使用与维护1.学习镜检疟原虫之前，必须熟悉显微镜的基本构造，使用方法和维修与保养。
防止油镜进灰、进油和发霉2.疟原虫的厚薄血片都必须在油镜下观察，显微镜用光要充足包括反光镜、光圈、聚光器要达到油镜使用的最佳限度显微镜检查注意事项n3. 玻片未加油时观察标本应按：低 倍→高倍→油镜程序如在加油区 内重找目标应按照：低倍→油镜程 序，不要经高倍镜，以免油沾污镜 头n注意保护镜头，切不可压碎标本被 片，损坏镜头 显微镜检查注意事项4.视野模糊不清显微镜问题：镜头镜油用量、沾污灰尘或含有气泡；油镜头破损、进油或有霉斑、灰尘；显微镜用光调整不足血片问题：载玻片不洁、毛玻璃样或有霉斑；血片染色过度或血膜过厚显微镜检查注意事项显微镜检查注意事项5. 应先学会看薄血膜，掌握薄血膜上各期的形态特征后，再学看厚血膜对熟练的镜检员一般以镜检厚血膜为主,以提高阳性检出率，薄血膜可作虫种鉴定及形态识别之用6. 油镜使用完毕，需用擦镜纸沾取少量二 甲苯将油擦去，并将残留的二甲苯擦n7.使显微镜的各部件恢复回原位，下降 镜筒，使物镜呈“八”字形置于载物台 上；n8 显微镜应存放在干燥阴凉的地方，不 要放在强烈的日光下暴晒，注意防潮生 霉；谢 谢。