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1、实验动物胚胎工程n某教师请学生喝茶，有许多漂亮的茶杯 和几个 普通的陶瓷杯，发现大家都拿漂 亮的茶杯喝茶，因此痛苦的源泉就是来 源于-n我们只注重外面的东西，而忽视了最重 要的内在的东西 n有分别心， 有选择。n发怒，是用别人的错误惩罚自己。n烦恼，是用自己的过失折磨自己。n后悔，是用无奈的往事摧残自己。n忧虑，是用虚拟的风险惊吓自己。n孤独，是用自制的牢房禁锢自己。n自卑，是用别人的长处诋毁自己。摒弃 这些，你活着就不会很累。学会感恩n感激伤害你的人，因为他磨练了你的心 态；感激绊倒你的人，因为他强化了你 的双腿；感激欺骗你的人，因为他增进 了你的智慧；感激蔑视你的人，因为他 觉醒了你的自尊
2、；感激遗弃你的人，因 为他教会了你该独立。凡事感激，学会 感激，感激一切使你成长的人！” 李嘉诚儿子被绑架的故事n绑匪张子强找到李嘉诚，让他给20亿元，如果 你是李嘉诚你会怎么办？n李嘉诚平静地说，我现金有10亿元，另外的我 去银行取给你。张问他：你为何这么冷静?李回 答道：因为这次是我错了，我们在香港知名度 这么高，但是一点防备都没有，比如我去打球 ，早上五点多自己开车去新界，在路上，几部 车就可以把我围下来，而我竟然一点防备都没 有，我要仔细检讨一下。都怪我，我自己有钱 但却没有安保措施，被你们几辆车就把我拦下 来了。李嘉诚告诉南方周末记者，当时他劝告 张子强：你拿了这么多钱，下辈子也够花
3、了， 趁现在远走高飞，洗心革面，做个好人;如果再 弄错的时候，就没有人可以再帮到你了。 n后来张子强又打来电话，李说，你搞什 么鬼，怎么还有电话?张子强在电话中 说，李生，我自己好赌，钱输光了，你 教教我，还有什么是可以保险投资的?n 李嘉诚答道：我只能教你做好人， 但你要我做什么，我不会了。你只有一 条大路，远走高飞，不然，你的下场将 是很可悲的。李嘉诚最喜欢的句子n春有百花秋有月，夏有凉风冬有雪; 若无闲事挂心头，便是人间好时节 。 n发上等愿，结中等缘，享下等福;择 高处立，就平处坐，向宽处行 -左 宗棠n最喜欢青菜白饭，很少吃肉 ，创办 汕头大学何谓礼？n 礼者，示人以曲也。己弯腰则人
4、高 ，对他人即为有礼。因此敬人即为礼。n子曰：非礼勿视，非礼勿听，非礼勿言 ，非礼勿动。 n躬自厚而薄责于人，则远怨矣。n父母在，不远游，游必有方。n以直报怨，以德报德。 人无远虑，必有 近忧。 何谓智？n智者，知道日常的东西也。把平时生活中的东 西琢磨透了，就叫智。观一叶而知秋，道不远 人即为此。n默而识之，学而不厌，诲人不倦。不患人之不 己知，患不知人也。 n君子欲讷于言，而敏于行。 n可与言而不与之言，失人；不可与言而与之言 ，失言。知者不失人，亦不失言。 n巧言乱德，小不忍则乱大谋。n子曰：学而时习之，不亦说乎？有朋自远方来 ，不亦乐乎？人不知而不愠，不亦 君子乎？ n n知之为知之，
5、不知为不知，是知也。 n知之者不如好之者，好之者不如乐之者 。n子在川上曰：“逝者如斯夫（像流水一 样），不舍昼夜。” n三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 n曾子言曰：“鸟之将死，其鸣也哀；人 之将死，其言也善。” n子贡曰：“君子之过也，如日月之食焉 。过也，人皆见之；更也，人皆仰之。 ” 何谓信？n信者，人言也。远古时没有纸，经验技 能均靠言传身教。那时的人纯真朴素， 没有那么多花花肠子，故而真实可靠。n言必信，行必果。君子和而不同，小人 同而不和。 n毋欲速，毋见小利。欲速则不达，见小 利则大事不成。 n子曰：“吾十有五而志于学，三十而立 ，四十而不惑，五十而知天命，六十而 耳顺，七十而从
6、心所欲，不 逾矩。” 一棵开花的树n如何让你遇见我 在我最美丽的时刻 n为这 我已在佛前求了五百年 n求佛让我们结一段尘缘 n佛於是把我化做一棵树 n长在你必经的路旁 n阳光下 慎重地开满了花 n朵朵都是我前世的盼望 n当你走近 请你细听 n那颤抖的叶 是我等待的热情 n而当你终於无视地走过 n在你身后落了一地的 n朋友啊 那不是花瓣 n那是我凋零的心 第一节 实验动物胚胎工程概 述n 现代实验动物胚胎工程涵盖了所有 对配子和胚胎进行操作的技术方法，它 的研究重点在雌、雄生殖细胞到囊胚的 各个发育阶段上实施体外操作技术。n我国50年代首先对四大家鱼进行人工排 卵和授精；n有些专家利用外刺激的方
7、法使未受精的 蛙卵出现卵裂。n实验动物胚胎工程主要包括以下几个方面 ： 一、超数排卵（Superovulation） 二、同期发情（estrus synchronization） 三、胚胎移植（Embryo transfer） 四、胚胎培养（Embryo culture） 五、胚胎保存（Embryo preservation） 六、胚胎分割（Embryo split） 七、体外受精（In Vitro fertilization）八、显微受精（Microfertilization） 九、胚胎干细胞（Embryonic stem cell） 十、细胞核移植与克隆技术（Nuclear transpl
8、ation and clone ） 十一、卵的激活与孤雌发育（Ocyte activation and parthenogenetic development）第二节 超数排卵（Superovulation）n一、概述n在哺乳动物胚胎发育形成卵巢的过程中，就 确定了雌体一生可以产生的卵子数量。n如果是多胎动物，例如兔每次排出成熟的卵 子平均为9枚；KM小鼠平均每次排卵8枚左右 。而单胎哺乳动物每次只成熟卵1枚，一次两 枚以上者很少见。n超数排卵：经外源激素处理的雌性动物， 改变性周期，促进超常数的排卵，甚至可 以超常数十几倍。n最高排卵数：KM小鼠：83枚/只兔：88枚/只金黄地鼠：72枚/只
9、二、超数排卵的意义n充分利用雌性动物的繁殖潜能n在科研上可以在短时间内取得大量 的卵和胚胎n在生产中，可以提高优秀动物的繁 殖数量，提高产量，增加经济效益 。三、超排方法通常采用激素进行超数排卵，常用的激素 ：促卵泡激素（FSH）促黄体激素（LH）孕马血清促性腺激素（PMSG）人绒毛膜促性腺激素（HCG）多采用PMSG与HCG或FSH与LH配合使用 。n人：指在前一周期的黄体期开始应用GnRH 激动剂，短方案是指在月经周期的第2天开始 应用GnRH（促性腺激素释放激素）激动剂 ，当卵泡成熟后，给予hCG注射，以促进卵 子最后成熟。通常在注射hCG后36-38小时取 卵。n取卵n 医生在B超引导
10、下应用特殊的取卵针经阴 道穿刺成熟的卵泡，吸出卵子。 n妊娠的确定n 在胚胎移植后14天测定血清HCG ，确定是否妊娠。在胚胎移植后21天再 次测定血清HCG，以了解胚胎发育的情 况。在胚胎移植后30天经阴道超声检查 ，确定是否宫内妊娠，有无胎心搏动。 副作用n卵巢过度刺激综合征(OHSS)n 由于多个卵泡生长，导致体内一些因子 发生改变，使得血管内液体漏到腹腔，甚至 胸腔内，引起胸腹水。发生率约为10%。多 数人症状较轻，表现为腹胀、腹部不适、轻 度恶心，可以不予处理；但少数人会出现严 重腹胀、少尿、腹痛、纳差，甚至出现胸闷 、气短等症状，此时需要给予静脉补液，甚 至收入院治疗。不足1%的人
11、可能发生血栓或 肾功能衰竭。 n不同的动物采用的激素及剂量：家兔：FSH或LH总剂量为3060 IU金黄地鼠：PMSG和HCG各30 IU小鼠：PMSG和HCG各5 10 IU第二节 同期发情n同期发情是胚胎移植的基础，也是 胚胎移植成败的重要因素。n受体的生殖生理原则上必须与供体 的胚胎期完全同步，这样的受体生 殖道的内环境才具备同期胚胎发育 的适合度。n实践中受体动物的发情期可稍早于 胚胎期n大动物如山羊绵羊等动物主要采用前列 腺素类的激素如用15-甲基PGF2或氯前 列烯醇等激素使黄体溶解来达到同期发 情的目的。n小型啮齿类动物如小鼠可通过挑选发情 母鼠与结扎公鼠交配，来达到同期发情 的
12、目的，称为假孕母鼠第三节 胚胎移植n胚胎移植是胚胎工程的一项重要技术， 它是胚胎工程的重要基础，转基因动物 、基因敲除动物、胚胎切割、体外受精 、显微受精、细胞核移植、嵌合体胚胎 等都要通过胚胎移植获得目的动物。n小鼠胚胎移植主要由以下一些步骤组成 ：1.结扎公鼠2.超数排卵3. 同期发情4. 胚胎收集和预处理5.胚胎移植以小鼠为例：n1.结扎公鼠的制备为了获得同步发情的假孕母鼠，要 准备结扎公鼠，通常选用5周龄公鼠做 输精管结扎手术，分笼饲养，每笼一只 。术后23周即完全康复，可用其生产 假孕母鼠。以小鼠为例： 2.超数排卵腹腔注射PMSG 10U，一 般选择在中午注射，间隔 48小时后注射
13、HCG，光照 周期保持1214h。n将注射HCG后的母鼠与正常 公鼠合笼，并于第二天早上 检查阴道栓，如果见栓说明 已经配上种了，计做怀孕0.5 天。n3.受体同期发情选择68周龄健康母鼠或经产母 鼠为受体母鼠，在给供体母鼠注射 HCG并与公鼠合笼的同时，将受体母 鼠与结扎公鼠合笼，第二天早上检查 阴道栓，有栓的母鼠可用于胚胎移植 。n4.胚胎收集和预处理 （1）受精卵的收集和处理 见栓当日的胚胎处于1细胞期。以脱颈椎法杀死母鼠，暴露子宫、 输卵管；剪下子宫、部分输卵管，并置 于M2培养液；在体视显微镜下撕开壶 腹部，释放受精卵。n用透明质酸酶处理受精卵细胞团随后在新鲜的、不含透明质酸酶的M2
14、中洗涤4-6次（2）28细胞胚胎的收集可取1细胞受精卵在体外发育而成，也可交 配后2060小时，输卵管中存在有28细胞期胚 胎。此时卵丘细胞已经脱掉，可用1ml的注射器 自输卵管伞口冲得胚胎。其基本步骤如下：取输卵管 找到输卵管伞部 将冲卵针 插入喇叭口 推压注射器 输卵管另一端收 集胚胎 洗涤胚胎 转入培养过程。（3）桑葚胚与囊胚的收集交配后6072小时，一些致密的 8细胞胚胎已进入子宫。而桑椹胚 和囊胚的收集则一定要从子宫中获 得。采集方法：剪下子宫，在宫管结 合部插入冲卵针，推入冲卵液，在 子宫 的另一端收集胚胎。以小鼠为例 （4）胚胎移植输卵管移植用5戊巴比妥纳 （0.40.6mL/只
15、） 麻醉受体母鼠，剪去 背侧毛胚胎：2-8 cell;受体：刚交配的 假孕母鼠n用手术剪切开小鼠的皮肤、肌肉、打开 腹腔，暴露卵巢、卵巢脂肪垫，并用镊 子夹住脂肪组织，把卵巢、输卵管和一 部分子宫角慢慢拉出。 n将小鼠及其暴 露的输卵管放 在解剖显微镜 下，找到输卵 管膨大的壶腹 部n用移卵管吸取胚胎，次序为石蜡油 、空气泡1、培养液、空气泡2、 胚胎(尽可能少带入培养液)。空气 泡3、培养液。 子宫移植胚胎：桑葚胚或囊胚；受体：交配后3天的假孕母鼠麻醉、剪毛、消毒；背部近中线处，最后肋 骨水平上，纵向切开皮肤、腹壁，在白色脂 肪体上方开一小口剪开腹膜，用钝镊子夹住 脂肪体，从切口拉出，继之卵
16、巢、输卵管、 子宫相继被拉出，并小心地移入体视显微镜 下。 n用钝镊子轻轻夹往子宫上端，并用针头 在其下的子宫壁上扎1小孔。注意不要 触及血管。并保证针扎入子宫内腔。轻 轻拔出针头，沿该孔将移植管插入约 0.5cm，轻轻吹吸管，使培养液后面的 气泡达到吸管末端。这时，所有的胚胎 就已移入子宫内。子宫、卵巢、输卵管 推回腹腔，复位、缝合。 第四节 胚胎培养胚胎培养就是在体外仿造类似于 体内条件的环境，使胚胎在体外得到 与在体内一样的正常发育，这是胚胎 工程研究与应用中非常重要的步骤。胚胎培养的应用n(1)末成熟卵通过体外培养，使卵子成 熟后，进行体外受精。(2)受精卵经培养成为卵裂球以后，可 以提供胚胎移植或冷冻保存。（3）冷冻胚胎解冻后，经过培养，然后 再提供胚胎移植（4）为胚胎的体外操作提供了时间n（4）通过胚胎培养的实践，不断完善 胚胎培养条件，逐步地揭示胚胎细胞的 新陈代谢、发育生长等生命活动中更深 刻的奥秘。n（5）导人外源基因的受
