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1、电泳（electrophoresis）电泳的基本原理带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷 的电极作定向移动的现象称为电泳。生物分子都带 电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质 的pH及其组成。由于混合物中各组分所带电荷性 质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作 用下，各组分泳动的方向和速度也各异。因此，在 一定时间内各组分移动的距离不同，从而达到分离 鉴定各组分的目的。 n在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带 净电荷量（Q）与电场强度（X）的乘积。 FQX n质点的前移同样要受到阻力（ f ）的影响，对于一个 球形质点，服从Stoke定律，即：f 6 r （r为
2、质点半 径，为介质粘滞系数，为质点移动速度） n当质点在电场中作稳定运动时：F f 即：QX6r 迁移率u：单位电场强度下的电泳速度， 粒子的迁移 率在一定条件下决定于粒子本身的性质即其所带电荷 及大小和形状。 uv/E=q/6r v=QX /6r 在具体实验中，移动速度V为单位时间t（单位为s）内移 动的距离d（单位为cm），即Vd/t。电场强度X为单位 距离L（单位为cm）内电势差E（单位为伏特），即 XE/L。将这两个公式代入上述公式，得到 U=v/X=dL/Et d=u*Et/L 由此可以得到两种物质移动距离的差为 d=(dA-dB)=(uA-uB)Et/L 从这个公式可以看出物质能否
3、进行分离决定于二者的迁 移率。 影 响 因 素1. 待分离大分子的性质 ：所带的电荷、分子大小和形状，分子带的电荷 量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快 2. 缓冲液pH和离子强度：pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就 越大，电泳的速度也就越大 ；但是pH过高或过低引起蛋白变性，缓冲 液通常要保持一定的离子强度；强度过低，则缓冲能力差，不易维持PH 恒定，离子强度过高，在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子 扩散层（即离子氛），降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。一般 所用离子强度为0.02-0.2之间。3. 电场强度：过高，产热，样品和Buffer扩散增加，条带增
4、 宽；蛋白变性。过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电 场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置4. 电渗 ：在 电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗 方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两 者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。5. 支持介质的筛孔 ：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所 受到的阻力也就越大分 类按支持介质的不同可分为： 纸电泳（Paper electrophorisis） 醋酸纤维薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis） 琼脂凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis） 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylam
5、ide Gel electrophoresis）（PAGE） SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）。按支持介质形状不同可分为： 薄层电泳 ； 板电泳 ； 柱电泳 聚丙烯酰胺电泳（PAGE）血 清 蛋 白 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳n目的： 1.掌握醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临 床意义 2.熟悉电泳仪器的使用和操作n原 理：血清蛋白在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在 ，分子大小、形状各有差异。在电场作用下，可在醋酸纤维 膜上分离成。A、1、2、五条区带。电泳结束后 ，将醋酸纤维膜置于染色液。使蛋白固定并染色，再脱色（ 洗去多余染料）。将染色后的区带分别剪开，将其溶与碱液 ，
6、进行比色测定，计算各区带的百分数。实验操作步骤及注意点1、准备与点样 1） 将已充分浸透的醋酸纤维膜取出，用滤纸吸去多余的 缓冲液。在膜的无光泽面距一端 2cm 处点样（膜不 能折；在膜上标记记号）。 2）用点样器蘸血清少许（ 不能看见有液滴形成 ），按在 点样处（点样要与膜边缘垂直，且大小均匀）。 2、电泳 将膜无光泽面向下，点样端置于阴极，膜与电极紧密 接触（不能留有气泡），平衡5min。通电，电压100V,时间 1 h 。 3、染色 电泳结束，将膜放入氨基黑 10B 染色，3min 后取出， 漂洗，反复几次，至背景漂净为止。用滤纸吸干薄膜。 4 、定量 1）取 6 支试管并编号，分别加入
7、 0.4N 氢氧化钠 4ml。 2）剪下各条蛋白带和在膜空白部位剪一条带（空白带的宽 度以最窄的条带为准， why？） ， 将各条带浸入试管， 不时摇动， 洗脱蓝色。 3）光光度计比色，波长为 650nm，以空白薄膜条洗出液为 空白对照，读取其它 5 管的光密度值。 5、计算总吸光度 光密度总和 TA12 各部分蛋白质的百分数： 蛋白质A/T100 +白蛋 白(A)12等 电 聚 焦 电 泳不同物质由于带电性质不同，因而在一定的电场强度下 移动的方向和速度不同,可以进行分离。蛋白质具有许多可解离的酸性基团（COOH）和碱性基 团（NH2）及其它基团,在一定溶液的pH条件下可解离成带 正电荷或负
8、电荷的基团。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子 的趋势相等，成为兼性离子，净电位为零，此时溶液的pH称 为蛋白质的等电点。NH3+ + OH NH3+ + OH NH2 P P P COOH H COO H COO 蛋白质的阳离子 蛋白质的兼性离子 蛋白质的阴离子 操作步骤及注意要点 凝胶配制 ：a 取10 0.5cm内径的玻璃管，从一端量出7cm作好标记， 用橡皮片封底（用两条橡皮圈扎紧），垂直放置。b 按实验指导page 17 配制凝胶液（按顺序，每加一种试剂 后都要轻轻充分摇匀，TEMED最后才加入，加入摇匀后要立 即灌胶），用长滴管吸取配好的凝胶液，沿玻璃管注入至7 m
9、l 标记平面，缓缓注入，避免产生气泡。c 立即用5ml注射器配针头注入约0.5cm高的蒸馏水，垂直放 置（将长滴管及时清洗）注意：丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒剂，对皮肤有刺激作用，注 意避免直接接触。电 泳将已聚合的凝胶去除水层，垂直插入电泳槽的橡皮管中 ，注意不要漏液。上槽注入5%H3PO4，下槽注入2%NaOH ，检查凝胶管上下口内有无气泡，如有必须排除。上槽接 正极，下槽接负极，50V预电泳30min，然后将电压维持在 250 V，电泳2小时。 剥 胶用带有针头的注射器吸入蒸馏水，将针头插入凝胶与水 之间，使针头慢慢螺旋前进。靠水流压力将胶与玻璃管分 开，最后可用吸耳球在一端轻轻施压，将其取下。 测 量 样 品 pI直接用pH试纸插入所需测定的蛋白区带中测量
