基因工程载体及其选用

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1、第九章基因工程载体及其选用1 1作为一个理想的载体，应具备以下条件： 载体：这种能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能 的DNA大分子称之为载体（vector）。 （1）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制 子和启动子，使插入基因复制和表达；（2）具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的， 这样可将多个外源DNA片段插入其中；（3）具有容易检测的筛选标记；（4）载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段 ，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝；（5）在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传 代而不易丢失。 2 2载体的种类：1. 克隆载体（cloning vector）：主

2、要是对目的基因克隆 ，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可； 表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿 主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要 有强启动子； 穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细 胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。3 3第一节质 粒4 4一、质粒的一般特性 (一) 质粒的分布、大小、数目 质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于 某些真核细胞（酵母的2环状质粒）。 质粒DNA分子量范围为1200106Da。 一个细胞内的质粒数量变化也很大，有1至几个 的，也有几十个的，甚至有数百个。这取决于质粒 的复制类

3、型。如果质粒的复制是严紧型的，每个细胞只有1个至 几个质拉；如果质粒的复制是松弛型的，每个细胞中质粒有10- 200拷贝数。5 5(二)质粒DNA的构型 三种不同的构型： 当其两条核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之 为共价闭合环形DNA(cccDNA)，这样的DNA通常呈现超 螺旋的SC构型； 如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结 构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环 DNA(ocDNA)。 若质粒DNA的双链均发生断裂而形成线形分子，则通称 为L构型。 6 6单链切割连接单链切割连接共价闭合环形DNA （SC型）开环DNA （oc型）线性DNA （L型）环形双链的质粒D

4、NA分子具有三种不同构型7 7(三)质粒DNA的理化性质 质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。 能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， 在一定pH下可解离而带电荷 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 比较能抗切割和抗变性。8 8(四)质粒DNA的生物学特性(1)寄生性：质粒只能在宿主的细胞内复制。(2)稳定性：每种质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。(3)同源性：不同质粒之间可能存在一定的同源区。(4)重组性：两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质 粒处于一种宿主细胞中，有可能发生质粒与质粒之间或质粒与 染色体之间的重组。(5)不相容性：有相同复制始区的不同质粒不能共存于同一宿 主细胞

5、中。该不相容性的分子基础主要是由于它们在复制功能 之间的相互干扰造成的。9 9(四)质粒DNA的生物学特性 (6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性 的质粒带有一套与传递有关的基因。 (7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法 将其去除。 (8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质 合成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋 白质合成的严格控制。 (9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的 抗性等。1010(五)质粒的命名原则 1976年提出一种质粒命名的原则，用小写字母p 代表质粒，在p字母后面用两个大写字母代表发 现这一质粒的作者或实验室名称。如pUC

6、118, 字母p代表质粒，UC是构建该质粒的研究人员的 姓名，118代表构建的一系列质粒的编号。1111二、组建理想质粒载体必须具备的条件 (一)质粒拷贝数较高 质粒拷贝数是指生长在标准的培养基条件下， 每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。1212根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成： 严紧型 松弛型 高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可高达高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可高达 10-6010-60份拷贝，这类质粒被称为份拷贝，这类质粒被称为“松弛型松弛型” 复制控制的质粒复制控制的质粒(relaxed plasmid)(relaxed plasmid)。 低拷贝数的质粒，每个宿主细

7、胞中仅含有低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有 1-31-3份的拷贝，称这类质粒为份的拷贝，称这类质粒为“严紧型严紧型”复复 制控制的质粒制控制的质粒(stringent plasmid)(stringent plasmid)；1313(二)分子量较小低分子量的质粒如下优点 通常拷贝数较高通常拷贝数较高 克隆时所预期的基因表达产物的数量较大克隆时所预期的基因表达产物的数量较大 限制酶的切点相应减少，有可能找到合适的单一限制限制酶的切点相应减少，有可能找到合适的单一限制 酶切点，便于制作酶切图谱。酶切点，便于制作酶切图谱。 外源外源DNADNA容量较大，容量较大， 容易转化，当质粒大于容易转化，

8、当质粒大于15kb15kb时，将成为转化效率的制时，将成为转化效率的制 约因素。约因素。 遗传工程操作时容易拿捏，容易分离，不易断裂。遗传工程操作时容易拿捏，容易分离，不易断裂。1414(三)带有可供选择的标记 常采用的标记是对某种抗生素的抗性，如氨卞 青霉素抗性(Ampr)、卡那霉素抗性(Kanr)、四 环素抗性(Tetr)等，而且希望各抗性基因内有 若干单一的限制酶切点。 在克隆时通过单一酶切点插入外源基因，使该 抗性基因失活、宿主菌变为对该抗生素敏感的 菌株，这样较易检查到克隆是否成功。1515-半乳糖苷酶筛选系统： 载体上带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子的DNA区段，这一区 段编码-

9、半乳糖苷酶氨基端的一个蛋白片段。IPTG(异丙基- -D-硫代半乳糖苷)可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿主 细胞所编码的-半乳糖苷酶羧基端的一个蛋白片段互补(-互 补)。故暴露于诱导物IPTG的细菌含有编码lacZ的质粒可同时合 成该酶的两种片段，该菌在其生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲 哚-半乳糖苷)的培养基上生长，将形成蓝色茵落。将一连串 克隆位点克隆入-半乳糖苷酶氨基端的基因中，外源DNA插入 质粒的多克隆位点后可使-半乳糖苷酶的氨基端片段灭活，从 而破坏了-互补作用。因此，带有重组质粒的细菌将产生白色 菌落。利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组子从空 载体中筛选出来

10、。1616lacZ-半乳糖苷酶分解半乳糖iPO调控蛋白P大肠杆菌的-半乳糖苷酶基因lacZ系统1717a-互补显色反应（蓝白斑筛选）lacZ -半乳糖苷酶-分解半乳糖iPO调控蛋白P-肽段分解X-gal产物呈现蓝色诱导剂IPTG-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M151818互补显色反应 1919(四)带有尽可能多的单一限制性酶切位点 单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入； 较多不同的单一限制酿酶切位点，可有选择地 供带有不同末端的外源基因插入。目前常用载 体上的多克隆位点(MCS)即具有该功能。2020(五)具有复制起始点(origin, ori) 这是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，也

11、是决定 质粒拷贝数的重要元件可使繁殖后的细胞维持一定 数量的质粒拷贝数。 例如含ColE1或pMB1复制起始点的质粒即为松弛型质粒 。 在一般情况下，一个质粒只含有一个复制起始点，构 成一个独立的复制子。穿梭质粒含有两个复制子，一 个是原核生物复制子、另一为真核生物复制子，以确 保其在两类细胞中均能得到扩增。2121三、常用的质粒载体 (一)克隆载体 pSC101质粒载体是第一个成功用于克隆真核DNA 的大肠杆菌质粒载体。 pBR322是用人工方法构建的符合理想质粒载体 条件的好载体，一度曾得到广泛的应用。 下面着重介绍目前常用的克隆质粒载体pUC系列 和pGEM系列。2222质粒重要的大肠杆

12、菌质粒载体松弛型复制 pBR322： 氯霉素可扩增拷贝数 50 - 100 / cell用于基因克隆 23232424pUC质粒载体(1)来自pBR322质粒的复制起点(ori)；(2)氨卞青霉素抗性基因(Ampr)，但它的DNA核苷 酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制酶 的单识别位点；(3)大肠杆菌-半乳糖苷酶(lacZ)的启动子及其 编码该基因氨基端-肽链的DNA序列,此结构特称 为lacZ1基因；(4)多克隆位点(MCS)区段：位于lacZ 基因中的靠 近5端，内含十几个单一的限制性内切酶识别切 割位点，使含有不同粘端的目的DNA片段可方便地 定向插入载体中。但它并不破坏lacZ

13、基因的功能 。2525质粒重要的大肠杆菌质粒载体pUC18 / 19： 拷贝数 2000 - 3000 / cell用于基因克隆和测序 装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记 lacZ2626pUC18质粒载体 优点: (1)具有更小的分子量在基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下pBR322的氨卞青霉素 抗性基因及复制起点，使其分子大小相应地缩小了许多如 pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。 更高的拷贝数：pBR322质粒的复制起点内部发生了自发的 突变，即rop基因的缺失。由于该基因编码的共63个氨基酸组成 的Rop蛋白质，是控制质粒复制的特殊因子，因此它的缺失使得 pUC8质

14、粒的拷贝数比带有pMBl或ColE1复制起点的质粒载体都要 高得多， 平均每个细胞即可达500-700个拷贝。所以由pUC8质粒重组体转 化的大肠杆菌细胞，可获得高产量的克隆DNA分子。2727(2)便于重组子的检测: pUC18质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子 的lacZ基因，所编码的-肽链可参与-互 补作用。因此，在应用pUC18质粒为载体的重组 实验中，可用X-gal显色法一步实现对重组子克 隆的鉴定。2828lacZlacZN端 C端缺陷型大肠杆菌完整的-半乳糖苷酶2929重要的大肠杆菌质粒载体pUC18 / 19：正选择标记 lacZ 的显色原理pUC18/19PlaclacZ

15、MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal3030(3)具有多克隆位点(MCS)区段 pUC18质粒载体具有与M13mP8噬菌体载体相同的 多克隆位点(MCS)区段，它可以在这两类载体系 列之间来回“穿梭”。因此，克隆在MCS当中的 外源DNA片段，可以方便地从pUC18质粒载体转 移到M13mp8载体上， 也正是由于具有MCS序列，可以使具两种不同粘 性末端(如EcoRI和BamHl)的外源DNA片段，无需 借助其它操作而直接克隆到pUCl8质粒载体上。3131pGEM系列 总长度为2743bp 含有一个氨卞青霉素抗性编码基因和一个 lacZ编码

16、基因 一段含有EcoR I、Sat I、Kpn I、Ava I、Sma I、BamH I、XbaI、Sall、AccI、Hinc I、Pst II、Sph I和Hind II等识别序列的多克隆位点 。 此序列结构几乎与pUC18克隆载体的完全一样。3232pGEM系列与pUC系列之间的主要差别 pGEM具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6 启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的 识别位点。 由于这两个启动子分别位于Lac z基因中多克隆位点 区的两侧，故若在反应体系中加入纯化的识别T7或SP6 启动子的RNA聚合酶，便可将已克隆的外源基因在体外 转录出相应的mRNA。 质粒载体pGEM-3Z和pGEM-4Z在结构上基本相似，两者 之间的差别仅仅在于SP6和T7