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1、第二节 基因工程的原理和技术温故而知新限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNADNA连接酶连接酶质粒质粒载体载体基因工程操作的工具剪切拼接导入表达（一）获得目的基因（一）获得目的基因（二）形成重组（二）形成重组DNADNA分子分子（三）将重组（三）将重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞（四）目的基因的检测和表达（四）目的基因的检测和表达基因工程的原理和技术1、筛选含有目的基因的受体细胞 2、目的基因的表达步骤一步骤一 获得目的基因获得目的基因人工合成(反转录法) 利用PCR技术扩增已知序列：从基因文库获得未知序列： ( DNA library )聚合酶链式反应(Polymerase
2、Chain Reaction)氢键断裂，形成单链DNA。引物与DNA模板结合， 形成局部双链。 在酶的作用下，不断延 伸，合成双链DNA。多次循环，获得大量 双链DNA分子。uPCR技术扩增利用PCR技术扩增目的基因目的基 因的 mRNA逆转录单链 DNA合成双链DNA（目的基因）蛋白质 氨基酸 序列推测mRNA的 核苷酸 序列推测结构基因 的核苷酸 序列化学 合成目 的 基 因人工合成法人工合成法 逆转录法根据已知氨基酸序列直接合成DNA鸟枪法：散弹射击法供体 细胞 DNA限 制 酶许多 DNA 片段载入运 载 体导入受体 细胞扩增产生 特定 性状分 离目 的 基 因从基因文库获得步骤二步骤
3、二 形成重组形成重组DNADNA分子分子可能存在情况：目的基因 载体步骤三步骤三 将重组将重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法(三)将目的基因导入受体细胞1.基因工程中常用的受体细胞有哪些？2.导入过程如何？大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵 母菌和动植物细胞借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径 受体细胞：细菌 CaCl2 细胞壁的通透性增大重组质粒进入受体细胞目的基因随受体细胞的繁殖而复制步骤四步骤四 筛选含有目的基因的受体筛选含有目的基因的受体利用标记基因来筛选：通过检测标记基因的有无，（或利用标记 基因体现的性状）来判断目的基因是否导 入
4、受体细胞。对目的基因进行分子水平的检测：通过合成标准探针，利用DNA杂交技术来 进行目的基因的检测。 DNA与DNA杂交，DNA与RNA杂家步骤五步骤五 目的基因的表达目的基因的表达1、通过鉴定目的基因的产物蛋白来 确定目的基因的表达。 抗原与抗体杂交2、目的基因导入受体细胞后，受体 细胞（或受体细胞发育来的生物体） 会表现特定的性状，通过性状的观察 来确定目的基因的表达。 引入病原体目的基因的检测与鉴定检查是否成功检测鉴定检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法DNA与DNA分子杂交DNA与RNA分子杂交抗原抗体杂交
