Chapter5_酶分子修饰

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1、1第五章 酶分子修饰Modification of Enzyme Molecule Molecule2Contents1、什么是酶分子修饰2、酶分子修饰的基本要求和条件3、酶分子的修饰方法4、酶修饰后的性质变化GoGoGoGo5、酶分子修饰的应用Go6、酶的定向进化Go31 什么是酶分子修饰n通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变 酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即： 在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质 ），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从 而改变酶的结构和性质。4n酶分子的完整空间结构赋予了酶分子催化功能，使其具有 催化效率高、专一性强和作用条

2、件温和等特点；但是，也 正是酶的分子结构使酶具有稳定性较差、活性不够高和可 能具有抗原性等弱点，使酶的应用受到限制。需要改变其 某些性质、提高其活性，以便更好地发挥其催化功能。于 是，酶分子修饰和改造的任务就被提出来了。n一般来说，人们是通过对酶蛋白分子的主链进行“切割”、“ 剪切”以及在侧链上进行化学修饰来达到改造酶分子的目 的的。被修饰、改造的酶分子，无论是物化性质，还是生 物活性都得到了改善，甚至被赋予了新的功能。人工设计 和合成具有生物活性的非天然大分子物质，是科学家们共 同努力的目标。5酶分子修饰的意义n通过酶分子修饰，可以使酶分子结构发生某些改变，就有 可能提高酶的活力，增强酶的稳

3、定性，降低或消除酶的抗 原性等。 n通过酶分子修饰，研究和了解酶分子中主链、侧链、组成 单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响 ，可以进一步探讨其结构与功能之间的关系。n20世纪80年代，酶分子修饰与基因工程技术结合，使酶分 子的组成和结构发生改变，获得了具有新的特性和功能的 酶，使酶分子修饰展现出广阔的应用前景。 62 酶分子修饰的基本要求和条件n对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的 选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。（1）酶的稳定性n热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。 （2）酶活性中心的状况 n活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基

4、 数等。7酶分子修饰的条件n修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活 性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。（1）pH与离子强度 npH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的 解离状态不同，反应性能也不同。（2）修饰反应的温度与时间 n严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修 饰反应。（3）反应体系中酶与修饰剂的比例83 酶分子的修饰方法n金属离子置换修饰n大分子结合修饰n酶分子侧链基团修饰n肽链有限水解修饰n核苷酸链剪切修饰n氨基酸置换修饰n核苷酸置换修饰n酶分子的物理修饰9(1)金属离子置换修饰n把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和

5、功能发生改变的 修饰方法称为金属离子置换修饰。通过修饰金属离子置换修饰，可以了解各 种金属离子在酶催化过程中的作用，有利于阐明酶的催化机制，并可能提高 酶活力，增强酶的稳定性，甚至改变酶的某些动力学性质。n有些酶分子中含有金属离子，而且往往是酶活性中心的组成部分，对酶催化 功能的发挥有重要作用。 -淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的 锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌 离子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+)等。n若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新 加入原有的金属离子，酶的

6、催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金 属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚 至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。 10n金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金 属离子的酶。包括如下步骤： A.酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质 ，获得具有一定纯度的酶液。B.除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯 合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与 EDTA等形成螯合物。酶此时处于无活性状态。C.加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子 ，酶蛋白与新加入的金属离子结合，

7、除去多余的置换离子，就可 以得到经过金属离子置换后的酶。用于金属离子置换修饰的金属 离子，一般都是二价金属离子。11n通过金属离子置换修饰可以达到下列目的：(1)阐明金属离子对酶催化作用的影响。(2)提高酶活力：如将锌型蛋白酶的锌离子除去，加进钙 离子，置换成钙型蛋白酶，其酶活力可提高2030%。(3)增强酶的稳定性。(4)改变酶的动力学特性：如酰基化氨基酸水解酶的活性 中心含锌离子，用Co2+置换后，对N-氯-乙酰蛋氨酸的米 氏常数Km增大，亲和力降低。12(2)大分子结合修饰n采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使 酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性 与功能的方法称为大分子结合

8、修饰。 它是目前应 用最广泛的酶分子修饰方法。13n大分子结合修饰主要过程：(1)修饰剂的选择：n大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二 醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环 状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。其中，聚乙二醇 是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、 无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后 可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。(2)修饰剂的活化：n作为修饰剂使用的水溶性大分子含有的基团往往不能直接与酶 分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过 活化，活化基团才能在一定条件下可以

9、与酶分子的某侧链基团 进行反应。n用于酶分子修饰的主要聚乙二醇衍生物有：聚乙二醇均三嗪 衍生物；聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物；聚乙二醇马来酸酐 衍生物；聚乙二醇胺类衍生物。 14大分子结合修饰主要过程(3)修饰：将带有活化基团的大 分子修饰剂与经过分离纯化的酶 液，以一定的比例混合，在一定 的温度、pH值等条件下反应一段 时间，使修饰剂的活化基团与酶 分子的某侧链基团以共价键结合 ，对酶分子进行修饰。例如，右 旋糖酐先经过高碘酸（HIO4）活 化处理，然后与酶分子的氨基共 价结合。(4)分离：酶经过大分子结合修饰后，不同酶分子的修饰效果往往有所差别，需要通过凝 胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰

10、度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果 的修饰酶。15n大分子结合修饰的作用：(1)通过修饰提高酶活力：每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐 结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋 白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍。(2)通过修饰降低或消除酶蛋白的抗原性：酶对人体来说是一种外源 性蛋白。当酶进入体内会成为一种抗原，刺激体内产生抗体；酶再 次进入体内，抗体就能和酶特异性结合，酶失去催化功能。二者的 特异结合是由它们之间特定的分子结构引起的。通过酶分子修饰， 使酶结构发生改变，可大大降低甚至消除酶的抗原性，从而保持催 化功能。16n大分子结合修

11、饰的作用：(3)通过修饰可以增强酶的稳定性。如何增强酶的稳定性，延长酶的半衰期 ，是酶工程研究的一个重要内容。为了增强稳定性，必须使酶的结构更为 稳定，特别是要使酶活性中心的构象得到保护。大分子结合修饰对酶的稳 定性有显著效果。不溶于水的大分子与酶结合制成固定化酶后，会显著提 高稳定性；水溶性的大分子与酶共价键结合，可在酶分子外围形成保护层 ，保护空间构象，从而增加酶的稳定性。酶 半衰期相对稳 定性天然SOD 6 min 1右旋糖酐-SOD 7 h 70Ficoll(低分子量)SOD 14 h 140Ficoll(高分子量)SOD 24 h 240聚乙二醇-SOD 35 h 350用聚乙二醇修

12、饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了 抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。17(3)酶分子侧链基团修饰n采用一定的方法（一般为化学法） 使酶蛋白的侧链基团发生改变，从 而改变酶分子的特性和功能的修饰 方法。n可以用于研究各种基团在酶分子中 的作用及其对酶的结构、特性和功 能的影响。在研究酶的活性中心中 的必需基团时经常采用。18n采用荧光试剂对酶分子侧链基团进行修饰，可研究溶液状态下酶 分子的构象。n可以测定某种基团在酶分子中的数量，如用三硝基苯磺酸测定氨 基的数量，用碳二亚胺测定羧基的数量。n可以提高酶活力、增加酶稳定性、降低酶的抗原性；可引起酶催

13、化特性和功能的改变，提高酶的使用价值。n可获得自然界原来不存在的新酶种，如抗体酶和人工改造的核酸 类酶等。n使核酸类酶的稳定性提高，并扩展核酸类酶的结构多样性，从而 扩展其催化功能，提高酶的催化活力。19酶的侧链基团n蛋白类酶主要由蛋白质组成，酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质 的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、 酚基、咪唑基、吲哚基等。这些基团可以形成各种副键，对酶蛋 白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起 酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。n核酸类酶主要由核糖核酸（RNA）组成，酶RNA的侧链基团是指 组成RNA的核苷酸残基上的功能团。RNA

14、分子上的侧链基团主要 包括磷酸基，核糖上的羟基，嘌呤、嘧啶碱基上的氨基和羟基（ 酮基）等。 酶的侧链基团修饰方法主要有：氨基修饰， 羧基修饰，巯基修饰，胍基修饰，酚基修饰 ，咪唑基修饰，吲哚基修饰，分子内交联修 饰等。20氨基修饰 n采用某些化合物使酶分子侧链上的氨基发生改变，从而改 变酶蛋白的空间构象的方法称为氨基修饰。n凡能够使酶分子侧链上的氨基发生改变的化合物，称为氨 基修饰剂。主要有：亚硝酸、2,4-二硝基氟苯(DNFB)、丹 磺酰氯(DNS)、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)、醋酸酐、琥 珀酸酐、二硫化碳、乙亚胺甲酯、O甲基异脲、顺丁烯 二酸酐等。这些氨基修饰剂作用于酶分子侧链上

15、的氨基， 可以产生脱氨基作用或与氨基共价结合将氨基屏蔽起来。21羧基修饰 n采用各种羧基修饰剂与酶蛋白侧链的羧基进行酯 化、酰基化等反应，使蛋白质的空间构象发生改 变的方法称为羧基修饰。n可与蛋白质侧链上的羧基发生反应的化合物称为 羧基修饰剂。例如，碳化二亚胺、重氮基乙酸盐 、乙醇盐酸试剂、异恶唑盐等。其中碳二亚胺 是酶分子羧基修饰最普遍采用的修饰剂。n用此修饰法可以定量测定酶分子中羧基的数目。 22巯基修饰 n采用巯基修饰剂与酶蛋白侧链上的巯基结合，使巯基发生改变，从而 改变酶的空间构象、特性和功能的修饰方法称为巯基修饰。n蛋白质分子中半胱氨酸残基的侧链含有巯基。巯基在许多酶中是活性 中心的

16、催化基团，它还可与另一巯基形成二硫键，故对稳定酶的结构 和发挥催化功能有重要作用。巯基的亲核性很强，是酶分子中最容易 反应的侧链基团之一。n通过巯基修饰，可以显著提高酶的稳定性。常用的巯基修饰剂有：酰 化剂、烷基化剂、马来酰亚胺、二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐 、硼氢化钠。其中烷基化剂如碘乙酸等，是重要的巯基修饰剂，经过 烷基化修饰过的酶分子相当稳定，而且通过荧光检测技术很容易检测 其修饰结果，从而也能对游离巯基进行定量分析。23胍基修饰 n蛋白质分子中精氨酸残基的侧链含有胍基。采用 二羰基化合物与胍基反应生成稳定的杂环，从而 改变酶分子的空间构象的方法称为胍基修饰。n用作胍基修饰剂的二羰基化合物主要有丁二酮、 1,2-环己二酮、丙二醛、苯乙二醛等。它们可以 在中性或者弱碱性的条件下，与精氨酸残基上的 胍基反应，生成稳定的杂环类化合物。24酚基修饰 n蛋白质分子的酪氨酸残基上含有酚基。通过修饰剂的作用 使酶分子上的酚基发生改变，从而改变酶蛋白的空间构象 和特性的修饰方法