第九章 疏水层析

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1、第九章 疏水作用层析 Hydrophobic Interaction ChromatographyHIC 原理 介质 技术 应用概述疏水层析分离的概念早在1948年由Tiselius提 出，真正发展是1970年开发出一系列适合疏 水层析的固定相以后；疏水层析的原理完全不同于离子交换层析或 凝胶过滤层析等技术，使该技术与后两者经 常联合使用来分离复杂的生物样品；目前该技术主要应用领域是在蛋白质的纯化 方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白 、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子， 甚至细胞等分离时的有效手段。 一、原理高浓度盐与水分子发生强烈作用 ，导致疏水分子周围形成空穴的水分 子减少，促进疏水

2、性分子与介质的疏 水配基之间发生结合 蛋白质等生物大分子与HIC介质的 结合不仅取决于分子疏水性表面的比 例，还与疏水补丁的分布有关; 一般来说每个分子被吸附的过程 都会有一个以上的配基参与，换句话 说，分子在介质上发生的结合是多点 结合. 疏水层析与反相层析的区别 ： RPC介质上疏水配基的取代程度大 大高于HIC介质，RPC更适合在水-有机 溶剂体系中具有良好稳定性的肽和小分 子蛋白质的分离纯化； HIC过程洗脱条件温和，通常降低 洗脱剂的盐浓度就能达到目的，在蛋白 质的纯化中有较广泛的应用。蛋白质种类TSK Gel Phenyl-5PW疏水柱中的 保留时间（min）SynChropak反

3、相柱中 的保留时间（min） 细胞色素c0.612.6肌红蛋白0.814.6核糖核酸酶A1.610.7伴清蛋白6.317.3卵清蛋白6.518.5溶菌酶8.514.3-葡萄糖苷酶15.65.3-胰凝乳蛋白酶16.613.6-胰凝乳蛋白酶原18.116.8乳过氧化物酶19.520.3牛血清白蛋白20.517.1铁蛋白20.816.612种蛋白质在疏水柱和反相柱中的选择性比较 疏水作用层析过程的参数 固定相类型：包括基质的类型、配基 的种类和取代程度 流动相组成：盐的种类和浓度、流动 相的pH、以及其他添加剂的影响 层析条件 ：温度、流速等 二、介质（基质+配基） 基质主要有多糖类如琼脂糖、纤维素

4、和人 工合成聚合物类如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯 类。其中，半刚性的琼脂糖类凝胶仍是应用 最广泛的疏水介质。 近年来研制超大(superporous)琼脂糖， 在扩散孔的基础上增加了对流孔，在流速较 高的条件下获较好的分辨率。 壳聚糖具有良好的生物相容性和化学稳定 性，近年来在疏水层析中也得到了应用 HIC介质的疏水配基主要为烷基和芳香 基，与反相层析介质相比，其烷基通常在 C8以下，芳香基多为苯基 R代表疏水配基，M代表基质。调节两种反 应物的比例可控制介质的配基密度 偶联至基质的 常见配基类型（A）丁基， （B）辛基， （C）苯基， （D）新戊基 对某些蛋白而言，上述有些配基与其结合力太强 ，

5、为洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；具中等疏 水的高分子配基(如聚乙二醇和聚丙二醇等)不仅可提 供足够的结合力，且避免了上述缺点。常用商品化疏水层析介质 Octyl Sepharose 4 Fast Flow工作pH范围为3-13,清洗pH范围为2-14,工作的最大 速度是600cm/h,配基结合量为每ml50mol正辛烷基， 疏水性中等，适合各种蛋白的分离和纯化。 Butyl Sepharose 4 Fast Flow工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的 最大速度是600cm/h,配基结合量为每ml 50mol 正丁烷 基，疏水性最弱，适合含脂族配体的生物分子。 Pheny

6、l Sepharose 6 Fast Flow疏水性最强，载量高，适合含芳香族配体的生 物分子的预处理，配基结合量为每ml 40 mol苯基 Phenyl ，工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14， 工作的最大速度是600cm/h 。 Phenyl Sepharose CL-4B疏水性较Octyl弱，适用于分离和纯化对疏水性 尚未了解的蛋白，配基结合量为每ml 40 mol苯基 Phenyl；工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14， 工作的最大速度是50cm/h 。三、技术 介质的选择 样品的准备 层析条件的优化 层析介质的再生、清洗和贮存 介质的选择在HPLC中，应选机械强度

7、较大的刚性基质 ；若待分离物质分子量很大，且样品量较大 ，则应选大孔基质，如琼脂糖凝胶；若待分 离物质较小，或样品量很小，但分辨率的要 求高，则可选孔径小的基质甚至非孔型基质HIC介质中，烷基配基的链长大多在C4C8 之间，苯基的疏水性大致与戊基相当，因与 溶质发生-相互作用，它与戊基有不同的 选择性，而寡聚乙二醇固定相的疏水性介于 丁基与苯基之间 。不同的介质对同一样品有不同的分离效果：样品的准备往样品中添加足够浓度的盐，使样品溶液中 的盐浓度达到与流动相A中基本一致，并调 节样品溶液的pH使其满足吸附条件 HIC的样品体积受样品中组分浓度和介质的 结合容量的影响，对于稀释样品无需浓缩可 以

8、直接加样 样品的加量问题层析条件的优化优化目标：目标分子达所需纯度的基础上，获得尽 可能高的回收率，同时力求缩短分离所需时 间、降低分离成本HIC中，层析条件包括流动相A，流动相B ，洗脱方式，层析柱的柱长，流速，温度等 流动相A与流动相B 流动相A的缓冲液的种类、pH ，盐的 种类和浓度的选择： 缓冲液种类据所需的pH选择，注意目 标物的稳定性，浓度一般在0.010.05mol/L ； 不同盐类对疏水作用的强度有影响， 层析中的选择性也不尽相同；盐浓度也随 目标分子的疏水性而异，(NH4)2SO4常用 0.752mol/L，NaCl为14mol/L流动相B为不含盐的缓冲液，缓冲液与 流动相A

9、一致蛋 白 质 结 合 容 量 （ mg/ ml 凝 胶 床 ）起始流动相中盐浓度对蛋白质结合容量的影响 起始流动相 条件的影响：若干蛋白质保留值（用Ve/V0表示）与流动相pH的关系（图中1为大豆胰蛋白酶抑制剂，2为人血清白蛋白，3为溶菌酶，4为 转铁蛋白，5为烯醇化酶，6为卵清蛋白，7为核糖核酸酶，8为卵胰蛋 白酶抑制剂，9为细胞色素c。） 洗脱的方式： （1）采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱 （最常用） （2）通过往流动相中添加有机溶剂 ，如：乙 二醇、丙醇、异丙醇等，降低流动相极性 的方式洗脱 （溶剂中稳定性良好的物质） （3）往流动相中添加去污剂等 ，去污剂本身 能与介质发生强烈吸附

10、，从而将结合在其 上的目标组分置换下来 （分离膜蛋白） 梯度洗脱和阶段洗脱 据试探性实验结果对洗脱进行优化（A）采用复合梯度洗脱；（B）采用阶段洗脱 AB温度升高会增加疏水作用，但注意蛋 白质等生物大分子在较高温度下会变性。 对特定的分离，操作温度需保持恒定，才 能确保层析结果具良好的重复性。 层析介质的再生、贮存 再生：常规用蒸馏水清洗，如有疏水性很强 的物质如脂类、变性蛋白等牢固结合在介质 上，则需合适的清洗剂进行清洗，NaOH溶 液是其中常用的一种清洗剂，它在清洗层析 柱的同时还能使微生物钝化灭活起到消毒的 效果。此外，促溶盐类的水溶液也是良好的 清洗剂 贮存：一般悬浮在20%的乙醇中，

11、如在水溶 液体系中保存，则需添加一定量的防腐剂， 以防止微生物的生长 四、应用蛋白类（包括酶）、肽类的分离重组蛋白的分离与复性活性蛋白与非活性蛋白的区分牛皮层骨中纯化酸性磷酸酶 ：ABCD（A）CM-Sepharose 阳离子交换层析，（B）磷酸纤维素亲和层析， （C）Sephacryl S-200凝胶过滤层析， （D）Phenyl-Sepharose疏水作用层析 Phenyl-Sepharose疏水作用层析条件：柱尺寸为201cm，4样品缓慢添加硫酸铵达 30%饱和度，轻搅2h，层析柱先用含30%硫酸铵的 100mmol/L的乙酸钠缓冲液（pH6.5）充分平衡， 将样品加入柱中，用200mL

12、上述含30%硫酸铵的缓 冲液清洗层析柱，用线性下降的盐浓度梯度洗脱， 300ml内从含30%硫酸铵的100mmol/L的乙酸钠缓冲 液连续过渡到不含硫酸铵的100mmol/L的乙酸钠缓 冲液纯化步骤总蛋白质（ mg）总活性（ mU）比活力（ mU/mg）纯化倍 数回收率（% ）Triton X-100-KCl 抽提1011.74491.34.4(1)(100)冻融提取719.14523.76.31.4100.7精蛋白硫酸盐处 理562.83792.26.71.584.4CM-Sepharose 阳 离子交换层 析23.53476.1147.933.377.4磷酸纤维 素亲和 层析11.1270

13、3.7244.455.060.2Sephacryl S-200凝 胶过滤层 析2.01279.2633.3142.628.4Phenyl-Sepharose 疏水作用层析0.11176.28144.91834.426.2酸性磷酸酶分离纯化各步骤的纯化倍数和酶活性回收率近年来，随着层析技术的发展， 与HIC相关的其它层析技术也得到了 发展，主要有以下两种：1）亲硫性疏水层析(thiophilic chromatography)2）疏水电荷诱导层析(HCIC) 发展趋势亲硫性疏水层析该技术主要在疏水作用的基础上增加了硫元 素的相互作用。利用层析介质与含硫蛋白质 和非硫蛋白质的亲硫性差异，对蛋白质加

14、以 分离。具体应用条件和HIC类似。通常这类介质通过硫醚键将配基和基质联接 ，如ButylS-Sepharose 6 Fast Flow，已用 于乙肝病毒表面抗原的分离纯化 疏水电荷诱导层析(HCIC) HCIC是近几年来发展起来的一类不同于HIC的新技 术，由Burton等 1998年提出； HCIC与蛋白质的作用除了疏水作用，还有电荷间 的相互作用； HCIC与蛋白质的结合是由疏水作用推动的，与HIC 不同的是，这一过程通常是在不改变离子强度的条 件下实现的； 洗脱时也不像HIC那样通过改变盐的浓度而是由pH 值的改变来实现的。 通常HCIC的配基中含有吡啶环，中性时不会 带有电荷，而随着pH值的降低，吡啶环中的 氮原子会带有正电荷，这样和带同样电荷的蛋 白质发生排斥，从而实现解吸（机理如图）；另外，为了能在低盐浓度甚至无盐时对蛋白质 进行吸附，其配基密度比HIC要高；同时为了增加其选择性，配基结构中还常常含 有硫。 HCIC主要用于抗体的分离纯化 ，具有 价格低、效率高、化学稳定性强(可用lmol L NaOH清洗)、适用范围广(可用于IgG， IgA，IgE，IgM和抗体片段的分离)的特点 ，目前，已有商品化的介质，如Ciphergen 公司生产的MEPHyperCell；由于HCIC比HIC、IEC拥有更温和的吸 附和洗脱条件，在蛋白质类的分离上应用 前景广阔。