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1、精品PPT课件 浏览免费 下载后可以编辑修改。 http:/ http:/ http:/ http:/ http:/ /基因操作中大分子的分离和分析三、分子杂交分子杂交:指具有一定同源序列的两条核酸单链(DNA或 RNA),在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火 处理,形成异质双链的过程。由于操作方式相似,通 常将检测蛋白质的抗原抗体反应也看作是分子杂交。作用:用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质 是否存在,以及其相对分子质量的大小。分类:根据检测对象的不同可分为Southern杂交、Northern杂交、Western杂交。Southern杂交:即DNA-DNA杂交分析,检测样品中特定的
2、DNA及其含 量 。Northern杂交:即RNA-DNA杂交分析。检测样品中是否含有特定 基因的转录产物(mRNA)及其含量 。Western杂交:即利用抗原-抗体反应,检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。 Southern杂交1975年,英国Southern创建1.是一种检测DNA分子的一种方法,通过southern 印迹转移将琼脂糖凝胶上的DNA分子转移到硝酸纤 维素滤膜上,然后进行分子杂交,在滤膜上找到与核酸 探针有同源序列的DNA分子。2.主要步骤:(1)待测DNA样品的制备、酶切 (2)待测DNA 样品的电泳分离:琼脂糖凝胶电泳 (3)凝胶中DNA的变性:碱变性 (4)Sout
3、hern转膜:硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 (5)探针的制备 (6)Southern杂交(预杂交、杂交)预杂交的意义:将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白 封闭起来,防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。(7)洗膜 经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除 去。(8)杂交结果的检测3.Southern 印迹转移(转膜)印迹转移(blotting) :通过电泳将DNA、RNA或蛋 白质样品进行分离,使不同相对分子质量的的分子 在凝胶上展开,然后将凝胶上的样品通过影印的方 式转移到滤膜上的过程称为印迹。4.探针及探针的标记探针:分子杂交中被标记的已知序列的核酸片断
4、 称为探针。(1)探针的种类:根据探针的标记物不同:放射性探针和非放射性探针;根据探针的来源及核酸性质不同:分为DNA探针,RNA探 针,cDNA探针,及寡核苷酸探针等几类。Western杂交中的抗体被看作探针。(2)探针的标记:i)标记物同位素标记:32P、35S、3H等非同位素标记:生物素、地高辛、荧光素等ii)标记方法a 均匀标记b末端标记带有放射性的已知序列的核酸片断标记已知序列的核酸片断5 标记已知序列的核酸片断3 a 切口平移法(nick translation):大肠杆菌的DNA聚合 酶b 随机引物法(random primer):六核苷酸残基的引物c PCR扩增标记法:d末端标
5、记法: 53355353 55PCR扩增法标记示意图T4-多核苷酸磷酸激酶(T4-PNP)T4-PNP的基本特性:在DNA、RNA、dNR、NR的5-OH上加磷5 HO 3 HOOH 3 OH 5 T4-PNPMg2+ pppATP(g-32P-ATP3 HOp 5 5 p HO 3 a. 放射性标记的优缺点:制作简单、 高比放射性、 放射自显影效果好。优点:缺点: 半衰期短(32P只有14.3天)、 不易保存、 对人体有害。 要求在专门实验室操作。(3)标记物及其检测b.非放射性标记: 地高辛标记n地高辛可以与dNTP连接成地高辛-dUTP( UTP)等,参 入DNA(RNA)的合成过程,形
6、成地高辛标记的DNA(RNA) 探针。n利用抗地高辛的抗体通过酶联免疫反应来完成。探针检测原理探针检测原理地高辛探针序列待测基因地高辛抗体酶底物产物探针DNA用地高辛标记。地高辛抗体与酶偶联。酶催化一个显色反应。地高辛抗体与地高辛结合。偶联酶及其底物偶联酶及其底物酶: 碱性磷酸酶 (Alkaline Phosphatase, AP)催化一些特殊的反应,反应的过程生成有色的 产物。酶的作用:AP的显色反应底物(4) 单链探针的获取f1-orilacZPT7MCSpBluescriptPT3 2958 bp AprNorthern 印迹杂交(Northern bloting)n检测RNA(主要是m
7、RNA)的方法n与Southern杂交的不同q靶核酸:RNAqRNA电泳q转膜:不需变性Western杂交印迹转移的是蛋白质 杂交过程:抗原抗体反应 探针是针对某一蛋白质的特异性的抗体。其他分子杂交菌落杂交:就是将细菌菌落影印到滤膜上,或将菌种点种在滤膜上然 后再生长出可见的菌落,对滤膜上的菌体进行原位裂解使 DNA 释放 出来,并使之固定在滤膜上。然后通过分子杂交,判断哪个或哪些菌 落含有与探针同源的DNA 。菌落杂交主要用来从用质粒或 Cosmid 构建的基因文库中寻找阳性克隆。噬菌斑杂交:以噬菌斑改为菌落。斑点杂交:是分子杂交中最简单的一种,直接将DNA或RNA分子以斑 点的形式固定在杂
8、交滤膜上,然后进行分子杂交。其杂交的信号比菌落杂交和噬菌斑杂交受到蛋白质等细胞成分的 干扰小,其结果的可靠性更强。当核酸分子的斑点面积变得更小,在单位面积滤膜上处理的样品数 量就更多,当检测的灵敏度进一步提高后,就发展成 DNA 芯片。 四、基因芯片技术 (一)、生物芯片的定义 生物芯片(Biochip)是指通过机器人自动印迹或光引导化学合 成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列 ,根据分子间的特异性相互作用的原理,将生命科学领域中不连 续的分析过程集成于芯片表面,以实现对细胞、蛋白质、基因 及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。基因芯片:又称 DNA 芯片或DNA阵列,
9、是生物芯片的一种类型, 它是将 DNA 分子固定于支持物上,并与标记的样品杂交,通过 自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中靶分子的数量, 进而得知样品中mRNA的表达量。也可进行基因突变体的检 测和基因序列的测定。上个世纪末,本世纪初，1996 年,清华学界对中医气本质，经络实质，阴阳，五行，藏象，中医哲学观等都有了新的全面整体创造性的认识和解说。如，邓宇等发现的:气是流动着的信息能量物质的混合统一体；分形分维的经络解剖结构；数理阴阳；中医分形集：分形阴阳集阴阳集的分形分维数，五行分形集五行集的分维数；分形藏象五系统暨心系统、肝系统、脾系统、肺系统、肾系统；中医三个哲学观新提出的第三哲学观
10、：相似观分形论等。 还包括近代针灸经络的发展史,近代中医气的进展简史,中西医结合史,中医中药史等.在明朝（1368 年1644 ），著名医学家李时珍的医学巨著本草纲目成书，这本书不仅是药物学专着，还包括植物学、动物学、（45传染病q566 丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）矿物学、化学等方面的知识。本草纲目刊行后很快传入日本、朝鲜及越南等亚洲地区，（df肺 25s血液f369血小板t5172 红血球gdf55m 白血球fd2）在公元17、18世纪先后被翻译成多种欧洲语言。另一方面，李时珍是世界上第一个提出大脑负责精神感觉、又发现胆结石病、利用冰敷替高热病人降温以及发明消毒技术的医学家。此
11、外还有王叔和的脉经、皇甫谧的针灸甲乙经、陶弘景的本草经集注、葛洪的肘后备急方、巢元方的诸病源候论、苏敬的新修本草 （df肺25s血液f369血小板t5172 红血球gdf55m 白血球fd2）、王焘的外台秘要、元丹贡布的四部医典、太平圣惠方、王惟一的铜人腧穴针灸图经等大量医学典籍问世。自明朝中医发展已经达到了顶峰，（45传染病q566 丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）出现了诸多的医学流派。同时在朝鲜研究中医的（df高血压958心脏病983u6 糖尿病87fr）所谓东医学也得到了很大的发展，例如许浚撰写了东医宝鉴。 （df4肺炎88gdg 青霉素 d25f肝炎df6）自清朝末年，中国受西
12、方列强侵略，国运衰弱。同时现代医学（西医）大量涌入，严重冲击了中医发展。中国出现许多人士主张医学现代化，中医学受到巨大的挑战。人们开始使用西方医学体系的思维模式加以检视，中医学陷入存与废的争论之中。同属中国医学体系的日本汉方医学、韩国的韩医学亦是如此。2003 年“非典”（df肺25s血液f369血小板t5172 红血球gdf55m 白血球fd2）以来，经方中医开始有复苏迹象。（df高血压958心脏病983u6 糖尿病87fr） 在文化大革命期间，中医作为“古为今用”的医学实例得到中国共产党政策上的支持而得以发展。现代，中医在中国仍然是治疗疾病的常用手段之一。（4f肿瘤fbb癌症yuw3胃癌d
13、65io肠癌.f2tr肺癌65ff） 近代、现代医学史 近代的医学（45传染病q566 丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）西方近代医学是指文艺复兴以后逐渐兴起的医学，一般包括16世纪、17世纪、18世纪和19世纪的欧洲医学。 16世纪 封建社会后期，手工业和商业发展，手工工厂出现，生产力的增长也促进对新市场的寻找。1492 年哥伦布发现新大陆,1497 年达伽马发现好望角,1519 1522 年麦哲伦环绕世界一周。（df高血压958心脏病983u6 糖尿病87fr）许多药物（如鸦片、樟脑、松香），由东方传入欧洲，美洲发现后，欧洲也有了金鸡纳、愈创木、可可果。 （df4肺炎88gdg 青霉
14、素d25f肝炎df6）由于资本主义的兴起，首先在意大利形成了资产阶级的知识分子。他们的特点是敢于向教会思想挑战，反对宗教迷信的束缚。他们的口号是：（df肺25s血液f369血小板t5172 红血球gdf55m 白血球fd2） “我是人，人的一切我应该了解”，以此来反对神学的统治。他们一方面传播新文化,一方面竭力钻研和模仿古代希腊的文化,因此此时期称为“文艺复兴”。1543 年哥白尼出版天体运行论，是科学史上文艺复兴的开始。 （45传染病q566 丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）医学革命。文艺复兴运动中，怀疑教条、反对权威之风兴起。于是，医界也产生了一场以帕拉切尔苏斯(14931541)
15、 （df高血压958心脏病983u6 糖尿病87fr）为代表的医学革命。 （4f肿瘤fbb癌症yuw3胃癌d65io肠癌.f2tr肺癌65ff）中世纪的医学校中,主要讲阿维森纳的医典,以及加伦和希波克拉底的著作。教师照本宣科，一切墨守成规，毫无生气。文艺复兴的狂潮，很快就波及医学领域。帕拉切尔苏斯指出人体的生命过程是化学过程。他在巴塞尔大学任教时主张用流行的德语写书和讲演，使医学易为大众所接受，这是一件伟大的改革。他重视实践，反对烦琐的经院哲学，反对中世纪顽固的传统和权威观念，他说：“没有科学和经验，谁也不能成为医生。（df肺25s血液f369血小板t5172 红血球gdf55m 白血球fd2）我的著作不是引证古代权威的著作，而是靠最大的教师经验写成的”。他勇敢地向墨守成规和盲目崇拜进行斗争，公开焚毁了加伦和阿维森纳的著作。 人体解剖学的建立。古代的人认为身体是灵魂寄居之处,在封建社会,各民族无例外地禁止解剖尸体。（df高血压958心脏病983u6 糖尿病87fr）因此,人体解剖学得不到发展,这个时 代的医书如加伦所著的解剖学中，解剖图几乎全是根据动物内脏绘成的。反之，文艺复兴时代的文化，把人作为注意的中心，在医学领域内人们首先重视的就是研究人体的构造。（45传染病q566 丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh） 首先革新解剖学的是意大利的达芬奇，他认为作为现实主义的画家，
