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1、质粒DNA的提取、纯化、酶切 、电泳、 紫外分光光度法定量 测定朱文博 中山医学院v基因克隆示意图分、切接转筛基因工程v定义：实现基因克隆所采用的方法及相关的工 作统称为重组DNA技术，又称重组DNA技术 。基因载体基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒质粒(plasmid)、噬菌体噬菌体(phage)和病毒病毒(virus)柯斯质粒柯斯质粒。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行 筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 实验内容2.2.限制性内切酶的酶切鉴定限制性内切酶的酶切鉴定(P83)(P83)3.3.定性鉴定定性鉴定:DNA:DNA 的琼脂糖凝胶
2、电的琼脂糖凝胶电 泳泳(P28)(P28)4.4.定量检测：定量检测：DNADNA 的紫外分光光度法的紫外分光光度法 测定测定(P37)(P37)1.1.质粒质粒DNADNA的提取与纯化的提取与纯化(P70(P70碱法碱法) )实验目的掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的 作用 ;掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切 酶掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳的原理和步骤；掌握紫外分光光度计对DNA含量的测定方法。一.质粒DNA的提取1 关于质粒的概念 a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？71.1 质粒的定
3、义质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分 子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般 不整合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。8(1) 超螺旋DNA (supercoiled DNA, SC DNA)1.2 质粒的三种构型9(2) 开环DNA (open circular DNA, OC DNA)如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能发 生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。10(3) 线状DNA (linear DNA, L DNA):如果两条链均断开，即为线状DNA。电泳时，三者泳动速度大小关系（？）11最快中最慢1.3 质粒DNA的一
4、般特性：(1) 质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。(2) 它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型：菌毛、抗药性等(3) 它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。(4) 质粒DNA与宿主菌染色体DNA的两点不同： 宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA要大得多 纯化分离的宿主菌DNA多为线性分子，而质粒 DNA呈闭合环的形式。13131.4 提取质粒DNA的目的与意义：基因载体/基因克隆/基因工程2.1 提取质粒DNA的常规方法(1)SDS碱裂解法(2)煮沸法(3) high pure plasmid isolation kit等。但原理相似，都是利用宿主染色体DNA和质粒DNA 的差
5、异来分离的。2 提取大肠杆菌质粒DNA的 方法和原则2.2 分离纯化质粒DNA的主要步骤(1)培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择）(2)细菌的收集与裂解 v收集方法：高速离心的方法vv裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、 碱变性法碱变性法、沸水沸水 热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的 纯化方法等因素综合后加以选择。纯化方法等因素综合后加以选择。 (3)质粒DNA的纯化 v 常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等常用的方法有：超速离心、层析法、聚
6、乙二醇沉淀法等所有纯化方法都是利用了质粒所有纯化方法都是利用了质粒DNADNA相对较相对较 小及共价闭合环状的性质。小及共价闭合环状的性质。 2.3 核酸分离纯化的总原则：v (1) 保证核酸一级结构完整v (2) 排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、 糖、 有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）3. SDS-碱裂解法提取Puc119-U6重组质粒DNA3.1 实验原理：高碱细菌的细胞壁破裂，内容物释放染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA；线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状；双链DNA并不完全分离。高酸 中和 至中 性变性的染色体DNA
7、与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚 成网络状大分子不溶性沉淀物质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中纯化RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质3.2 主要试剂及作用溶液：由葡萄糖、EDTA、TrisHCl组成.(保护、缓冲) 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械剪切作用,防止破坏质粒. (保护作用) EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对质粒分子的降解作用。（保护作用） TrisHCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）19溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性) SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结
8、合使之 变性（裂解细胞和蛋白质变性作用） NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变 性作用）20溶液III：HAC(乙酸)和 KAC(乙酸钾)组成的高盐溶液(复性，分离)HAC溶液能中和溶液的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。3. 3 实 验 步 骤加1.5ml培养物于EP管，12000g30S除去上清，加入冰的200 l 溶液I，剧烈振荡EP管，室温3min加入200l 溶液II，快速颠倒数次，冰浴3min
9、加入150l 冰溶液III，温和振荡10s，冰浴5min，12000g5min转移上清到新EP管，加入等体积酚/氯仿(1:1)，温和振荡，冰浴3min， 12000g5min 上层水相转移到新EP管，加入2倍体积无水乙醇，颠倒混匀， -20 冰箱中放置15min，12000g10min 弃上清，沉淀中加1ml 70%乙醇，12000g5min 去上清，管平放室温静置10min， 20 l TE 溶解DNARCF =1.12r（rpm/1000)2RCF: 离心力（g）r: 离心半径（mm）rpm: 每分钟转速（r/min）注意事项：1、加样枪正确使用；2、标记自己所提取的质粒类型；3、废液倒在
10、水池中，枪头扔到垃圾桶中；4、加不同溶液要换枪头；5、离心前把管擦干；6、转移上清时不要吸到沉淀；7、吸取酚时枪头伸到下层溶液中，注意不要沾到 皮肤；8、 每人最终得到20ul质粒DNA，其中10ul用于酶 切和电泳，其余10ul用于下次的转化实验，切记！二、限制性内切酶切割重组质粒1 关于限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease） 1.1 定义能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子 的断裂,产生相应的限制性DNA片段。主要存在于细菌体内。切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶 切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。251.3 作用与甲基化酶共同构
11、成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。1.2 分类 、 （基因工程技术中常用型）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。1.4 命名Hin d属 系 株 序Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶2 BamHI 、Hind酶切质粒及鉴定2.1 实验原理：利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的 核苷酸序列，并切割DNA,产生一定长度的DNA 片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴 别目的基因（重组质粒DNA）28重组质粒BamHIHind III
12、双酶切电泳检测5-G A A T T C-3 3-C T T A A G-5BamHI5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5 Hind IIIPUC119 （3.2Kb ）U6启动子 （256bp ）2.2 实验材料:(1)重组质粒; (2)BamHI 、Hind 限制性内切酶;(3)反应缓冲液。312.3 实验步骤 (1)建立反应体系 (2)酶切反应（温育1-2h） (3)电泳鉴定322.4 双酶切体系 质粒DNA 10l10M buffer 2lBamH 1lHind 1lddH2O 6l33合计 20l准备室 老师已 加好同学自己加37 ，1-2h思考题？v为什么
13、要对重组质粒DNA进行双酶切？341 原理在在pH8.0pH8.0（碱性）的环境中碱性）的环境中DNADNA的磷酸基团解的磷酸基团解 离，使离，使DNADNA在该环境中带负电荷，在电场中向正极在该环境中带负电荷，在电场中向正极 方向泳动，因为各种方向泳动，因为各种DNADNA分子的电荷数、分子量、分子的电荷数、分子量、 构象不同，它们在通过凝胶立体网格时所受的动构象不同，它们在通过凝胶立体网格时所受的动 力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达 到分离的目的。到分离的目的。DNADNA显色剂多用显色剂多用EBEB，它能和碱基间的氢键结合它能和碱基间的
14、氢键结合 ，在紫外光照射下呈橘红色（，在紫外光照射下呈橘红色（530nm530nm）的荧光。的荧光。35三、酶切质粒DNA后的琼脂糖凝胶 电泳1.1 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素 v1 DNA分子的大小v2 构象v3 凝胶浓度v4 电压v5 缓冲液1.2 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围琼脂糖浓度（，W/ V ) DNA分子的有效分离范围（kb) 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-22 实验材料及试剂琼脂糖电泳缓冲液：1TAE10 加样缓冲液EB染色液 它能和碱基间的氢键结合，在波长为它能和碱基间的氢键结合，在波长为254nm365nm254nm365nm的紫外光照射下呈橘的紫外光照射下呈橘红色（红色（530nm530nm）的荧光）的荧光. . 琼脂糖凝胶板的制备（封板、制备1%凝胶、倒胶、插梳、凝固后拔梳）倒缓冲液，加样 （取酶切质粒DNA样品液 20l + 4 l上样缓冲液，混匀 ）电泳（100V 0.5小时，5V/cm）染色与检测（EB染色5 min，洗脱3min，紫外灯下检测）3 实验步骤一、电泳前准备准备内容作用1.刷干净电 泳制胶的梳子，板子 ，槽子，蒸
