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1、*PCRPCR，不只是温度循环，不只是温度循环杭州博日科技有限公司 肖强海2*PCRPCR基本原理基本原理变性退火延伸N个循环3*PCRPCR的基本成分的基本成分n模板DNAn特异性引物n热稳定DNA聚合酶n脱氧核苷三磷酸（dNTP）n二价阳离子（Mg2+/Mn2+）n缓冲液（Tris-Cl）n一价阳离子（KCl）34*原理简单，结果多变原理简单，结果多变n重复性差n假阳性n假阴性n扩增效率低nCt值出现的晚n标准曲线线性不佳WHY ?5*组分量很重要组分量很重要相互制约的平衡之道相互制约的平衡之道5Mg2+TaqKCl引物模板产物dNTPEDTA腐殖质盐离子盐离子模板引物复合物活性构象螯合螯
2、合螯合BufferDDTTween甘油6*反应温度时间很重要反应温度时间很重要动态竞争的过程动态竞争的过程n引物与引物，引物与模板的不同部位都会有一定的结 合力，只是大小有差异，取决于温度与浓度nDNA聚合酶与引物，与双链DNA（模板和产物），与 模板引物复合体都能结合，只是与后者结合力更强nDNA聚合酶与DNA的结合是动态的，在不断的结合与 分离nDNA分子之间的结合，以及聚合酶与DNA分子之间的 结合发生的温度范围很广，并非只有退火的时候才发 生。温度和时间决定了哪个产物能胜出7*原理简单，控制不易原理简单，控制不易n成分控制n体积控制n温度控制n时间控制78*成分控制成分控制n核酸抽提试
3、剂n引物合成可能有杂质n商品化的PCR试剂盒未标明成分89*体积控制体积控制n移液器n吸头n操作手法910*温度及时间控制温度及时间控制 滞后效应滞后效应10金属底座散热器耗材导热膜反应试剂半导体温度探头11*面对困难如何调整优化面对困难如何调整优化11试剂仪器耗材人模板 序列模板引物二级结构 GC含量完整度 抑制剂二聚体 错配让厂商去优化吧12*荧光定量荧光定量PCRPCR（QPCRQPCR）是咋回事？）是咋回事？nPCR全部循环跑完再检测一次产物量，在电泳仪上分 离后，用EB等染料染色，在紫外灯下检测。n通过荧光分子标记，QPCR每跑一个循环都检测一次 产物量，无需任何分离，在QPCR仪内
4、直接检测。n一个PCR反应产物检测只得到一个数据，只能粗略判 断终产物的量。n一个单色QPCR跑40个循环可以检测到40个数据，可 以更精确的推断出DNA的量。13*荧光分子简介荧光分子简介n荧光是一种光致冷发光现象。荧光分子经某种波长的入射光（ 通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立 即退激发并发出出射光（通常波长比入射光的的波长长，在可 见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失 。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。13荧光分子的性质(激发和 发射波长、强度、寿命、 偏振等)可随所处环境的 性质，如极性、折射率、 黏度等改变而灵敏地改变 。14*n非特异性荧
5、光染料：n1、 SYBR Green n特异性荧光探针：n 2、TaqMan（Taqman-MGB)n 3、Molecular Beaconn 4、LNA probesn 5、Scorpions primers n 6、FRET proben 7、Allglo探针n 8、蝎形引物（Scorpion primer）：荧光标记引物n 9、Amplifluor：荧光标记引物QPCRQPCR用什么荧光分子，怎么用？用什么荧光分子，怎么用？SYBR Green ，FAM， HEX，VIC， TET，JOE， CY3， TAMRA， NED，ROX ，CY5，LC- Red等等15*实时荧光定量实时荧光定
6、量PCR PCR 方法方法 1 1 SYBR Green SYBR Green 法法(EVA Green)(EVA Green)nExcites at 497 nm and emits at 520 nm.16*SYBR Green SYBR Green 染料工作原理染料工作原理SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发 荧光，在此阶段采集荧光信号。17*SYBR Green SYBR Green 法法 优缺点优缺点q 对DNA模板没有选择性-
7、适用于任何DNAq 使用方便-不必设计复杂探针q 非常灵敏q 便宜优 点q 容易与非特异性双链 DNA结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的 分析，优化反应条件q 对引物特异性要求较 高缺 点18*实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR方法方法2 2TaqManTaqMan法法TaqMan-水解型杂交探针与目标序列互 补 v 5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 v 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)v 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与 Q分开，发荧光v Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针19*实时荧光定量实时荧光定
8、量PCRPCR方法方法2 2TaqMan-MGBTaqMan-MGB法法 TaqMan-水解型杂交探针荧光素非荧光淬 灭基团与目标序列互补MGB(Minor Groove Binder)将探针的Tm值提高10因此，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低 了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。20*TaqManTaqMan法法 工作原理工作原理每扩增一条DNA 分子，释放一个 荧光信号，可以 在循环过程中任 一点检测荧光21*TaqmanTaqman法法 优缺点优缺点q对目标序列的高特异性- -阴性结果确定q设
9、计相对简单-与目 标序列某一区域互补q重复性比较好优 点q只适合一个特定的目标q委托公司标记，价格较高q设计及实验难度大q不易找到本底低的探针缺 点22*SYBR Green SYBR Green 法法PCRPCR反应的建立反应的建立反应体系的建立及优化:避免非特异产品 nSYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性， 太低，荧光信号太弱，不易检测 nPrimer：引物的特异性高，否则扩增有杂带 ，定量不准 nMgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特 异性产物 n反应Buffer 体系的优化 n反应温度和时间参数:由酶和引物决定 n其他与常规PCR相同 nEVA Green、
10、LC Green23*SYBR Green SYBR Green 法法 应用范围应用范围n 起始模板的测定n 基因型的分析n融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件， 对常规PCR有指导意义，如对primer的评价； 可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物 。nHRM24*TaqMan TaqMan 法法 PCRPCR反应的建立反应的建立1、引物、探针的设计：探针优先于引物 有软件可以辅助设计：Primer5、beacon design、Primer Express 探针Tm为68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-6
11、0 2、反应参数的确定（使用梯度功能）一般为：94 ，10-20S60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高）也可通过温度梯度优化退火温度72 ，45 S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同25*TaqmanTaqman法法 应用范围应用范围q 起始模板的定量q 基因型分析q 目的基因定量q 产物鉴定q SNP（单核苷酸多态性）分析26*实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法 3- Molecular 3- Molecular beacon beacon 法法( (分子
12、信标分子信标) ) 环茎荧光素 淬灭剂 标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成发夹型杂交探针27*Molecular beacon (Molecular beacon (分子信标分子信标) ) 工作原理工作原理探针游离时，呈发 夹结构，不能检测 到荧光 互补序列出现时， 探针与DNA结合， 探针转变成开放的 线性结构，产生可 被检测的荧光。28*Molecular beacon (Molecular beacon (分子信标分子信标) ) 应用范围应用范围q 起始模板的定量q 基因型分析q 产物鉴定q SNP（单核苷酸多态性）分析29*Molecular beacon (M
13、olecular beacon (分子信标分子信标) ) 优缺点优缺点q高特异性：对目 标序列检测SNP最灵敏 的试剂之一q荧光背景低优 点q 只能用于一个特定目标q 设计困难q 价格比较高缺 点30*实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 其他方法其他方法LNA probes- Locked Nucleic Acids碳环引入亚甲基桥 ，提高Tm的作用 Scorpions primers 31*实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 其他方法其他方法FRET probe Allglo探针 蝎形引物（Scorpion primer）：荧光标记引物 Amplifluor：荧光标记引物其他32*Q
14、PCRQPCR能定什么东西的量，怎么定？能定什么东西的量，怎么定？n绝对定量：用已知量的标准品做标准曲线，推算未知 的样本中基因的拷贝数或浓度。n相对定量：样本中目标序列相对于另一参照样本的量 的变化。常用于比较样本中基因表达水平的高低变化 ，得到的结果是百分比。 nSNP基因分析n其他3233*实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 扩增曲线扩增曲线荧光基团荧光检测元件 扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集34*一个极具重现性的参数一个极具重现性的参数CtCt值值Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct
15、值则极具重现性35*什么是什么是CtCt值，如何确定？值，如何确定？nCycle of thresholdnPCR反应管中的荧光信号达到特定值（threshold，阈 值）时候的所需要的循环数。n不同的数据分析方法（样点拟合法/基线阈值法，最 大二阶导数法）得到的Ct值不同，一般选用前者。3536*实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理CtCt值值Ct值的定义-样点拟合法（基线阈值法）：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定 的域值时所经过的扩增循环次数C(t) value 37*实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理荧光阈值原理荧光阈值荧光信号阈值 （threshold ）：q 前15个循环信号作为荧光本底信号（ baseline），即样本的荧光背景值和阴性 对照的荧光值q 荧光域值的缺省设置是315个循环的 荧光信号的标准偏差的10倍q 手动设置：原则要大于样本的荧光背 景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽 量选择进入指数期的最初阶段，并且保证 回归系数大于0.99q 真正的信号:荧光信号超过域值38*实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理CtCt值值Ct值的定义-最大二阶导
