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1、内科学内科学( (消化系病消化系病) )专业优秀论文专业优秀论文 骨形态发生蛋白骨形态发生蛋白-4-4 在在 BarrettBarrett 食食管发生中的作用及机制研究管发生中的作用及机制研究关键词:骨形态发生蛋白关键词:骨形态发生蛋白 食管腺癌食管腺癌 鳞状上皮细胞鳞状上皮细胞 食管粘膜食管粘膜 蛋白表达蛋白表达摘要:背景和目的: Barrett 食管(BE)指食管下段鳞状上皮细胞被柱状上 皮细胞替代。大多数食管腺癌发生在 BE 基础上,而后者被认定为胃食管反流病 (GERD)的并发症。新近观点认为胃酸与胆盐是诱发具有遗传倾向患者发生 BE 的 环境因素,二者均可直接损伤食管粘膜上皮诱发 B
2、E 发生,但具体分子发生机制 尚不明确。最近的研究发现 TGF- 家族中的 BMP4 可能参与这个过程,相对于 正常食管粘膜,BMP4 在食管炎与 Barrett 食管粘膜中的表达明显上调,并可以 诱导正常食管鳞状上皮细胞细胞角蛋白表达发生变化。实验证明 BMP4 具有广泛 的作用,如诱导成骨、维持胚胎正常发育、诱导干细胞分化等等,但在 BE 表达 上调的机制及意义尚不清楚。为此本课题的研究目的是研究酸与胆盐对于正常 食管鳞状上皮细胞 BMP4 表达的影响,并探讨在食管上皮肠化生过程中 BMP4 所 发挥的作用及相关机制。 方法: 1.通过内镜检查下取材、改良消化酶、 应用完全 KSFM 培养
3、基探索简便易行的体外培养食管鳞状上皮细胞(EECs)的方法; 2.采用 RT-PCR、real-time PCR、Westernblot 等方法,研究酸与胆盐对 EECs BMP4 基因和蛋白表达的影响:3.采用细胞计数、Am-Blue 法检测重组人 BMP4(rhBMP4)对于 EECs 增殖与活力的影响;4.采用 RT-PCR、real-time PCR、Western blot 等方法,检测 rhBMP4 诱导的 EECs Villin、CDX2 mRNA 与 蛋白合成的变化,以及 BMP4 特异性拮抗剂 Noggin 对于酸诱导 EECs 表达 Villin 蛋白效应的影响,以明确 B
4、MP4 诱导食管上皮肠化生的作用;5.采用 Western blot 的方法,检测 rhBMP4 对 EECs Smadl 活化水平和 ID2 蛋白表达水 平的影响,以研究 BMP 信号通路在 BMP4 诱导肠化生中的作用。 结果: 1. 内镜下取材方法简便,并可获得足够活细胞。TrypLETM Express 较胰酶纯度高, 对细胞损伤小。原代培养 EECs 以基底层细胞为主,混以少量分化层细胞,无成 纤维细胞污染。长期传代培养细胞仍保持良好形态与增殖能力。 2.正常 EECs 未检测到 BMP4 mRNA 和蛋白表达。酸呈浓度与时间依赖性刺激 BMP4 mRNA 和蛋白表达,pH4.0 效
5、应最强并与 pH7.2 存在显著性差异(Plt;0.05)。混 合结合胆盐在 pH7.2 条件下轻度刺激 BMP4 表达(Plt;0.05),在 pH4.0 条 件下效应明显增强(Plt;0.05)。 3.rhBMP4 呈浓度依赖抑制 EECs 增殖 (Plt;0.05)、降低细胞活力(Plt;0.05),可能与 BMP4 促细胞凋亡有 关。 4.正常 EECs 不表达肠化上皮标志物 Villin、CDX2 蛋白,rhBMP4 可呈 浓度依赖性促进细胞表达这两种蛋白(Plt;0.05)。 5.慢性酸暴露可明 显上调 EECs Villin 表达(Plt;0.05),BMP4 特异性拮抗剂 No
6、ggin 可有效 抑制这种效应(Plt;0.05)。相对而言,短暂酸暴露对于 Villin 表达无影 响。 6.rhBMP4 可迅速活化 EECs 内 Smadl(Plt;0.05),并呈时间依赖性 增强 ID2 蛋白表达(Plt;0.05)。但撤去 rhBMP410 分钟后 P-Smadl 水平恢 复正常。 结论: 1.采用内镜下取材、改良消化方法、应用完全 K-SFM 培 养基可成功进行人 EECs 的原代和传代培养,并克服了传统方法中所存在的细胞 来源受限、易受成纤维细胞污染、细胞数量稀少、细胞传代困难等问题。 2. 胃酸从基因转录及蛋白合成水平上刺激 EECs 表达.BMP4,并呈时间
7、与浓度依赖性。单独胆盐的作用较弱,在胃酸存在条件下作用增强。提示胃酸可能是导致 Barrett 食管发生最重要的环境因素,而胆盐则可能起到协同效应。 3.BMP4 可抑制 EECs 增殖,促进 EECs 表达肠化上皮标志物 Villin 和 CDX2。而 BMP4 拮 抗剂 Noggin 可有效抑制酸诱发的 EECs 表达 Villin 蛋白。提示 BMP4 上调可能 是食管上皮肠化生过程中的关键点。 4.BMP4 可有效激活 EECs 内 Smadl,并 促进 ID2 蛋白表达,提示 BMP4 通过激活胞内的 BMP 通路参与 BE 的发生。正文内容正文内容背景和目的: Barrett 食管
8、(BE)指食管下段鳞状上皮细胞被柱状上皮 细胞替代。大多数食管腺癌发生在 BE 基础上,而后者被认定为胃食管反流病 (GERD)的并发症。新近观点认为胃酸与胆盐是诱发具有遗传倾向患者发生 BE 的 环境因素,二者均可直接损伤食管粘膜上皮诱发 BE 发生,但具体分子发生机制 尚不明确。最近的研究发现 TGF- 家族中的 BMP4 可能参与这个过程,相对于 正常食管粘膜,BMP4 在食管炎与 Barrett 食管粘膜中的表达明显上调,并可以 诱导正常食管鳞状上皮细胞细胞角蛋白表达发生变化。实验证明 BMP4 具有广泛 的作用,如诱导成骨、维持胚胎正常发育、诱导干细胞分化等等,但在 BE 表达 上调
9、的机制及意义尚不清楚。为此本课题的研究目的是研究酸与胆盐对于正常 食管鳞状上皮细胞 BMP4 表达的影响,并探讨在食管上皮肠化生过程中 BMP4 所 发挥的作用及相关机制。 方法: 1.通过内镜检查下取材、改良消化酶、 应用完全 KSFM 培养基探索简便易行的体外培养食管鳞状上皮细胞(EECs)的方法; 2.采用 RT-PCR、real-time PCR、Westernblot 等方法,研究酸与胆盐对 EECs BMP4 基因和蛋白表达的影响:3.采用细胞计数、Am-Blue 法检测重组人 BMP4(rhBMP4)对于 EECs 增殖与活力的影响;4.采用 RT-PCR、real-time P
10、CR、Western blot 等方法,检测 rhBMP4 诱导的 EECs Villin、CDX2 mRNA 与 蛋白合成的变化,以及 BMP4 特异性拮抗剂 Noggin 对于酸诱导 EECs 表达 Villin 蛋白效应的影响,以明确 BMP4 诱导食管上皮肠化生的作用;5.采用 Western blot 的方法,检测 rhBMP4 对 EECs Smadl 活化水平和 ID2 蛋白表达水 平的影响,以研究 BMP 信号通路在 BMP4 诱导肠化生中的作用。 结果: 1. 内镜下取材方法简便,并可获得足够活细胞。TrypLETM Express 较胰酶纯度高, 对细胞损伤小。原代培养 E
11、ECs 以基底层细胞为主,混以少量分化层细胞,无成 纤维细胞污染。长期传代培养细胞仍保持良好形态与增殖能力。 2.正常 EECs 未检测到 BMP4 mRNA 和蛋白表达。酸呈浓度与时间依赖性刺激 BMP4 mRNA 和蛋白表达,pH4.0 效应最强并与 pH7.2 存在显著性差异(Plt;0.05)。混 合结合胆盐在 pH7.2 条件下轻度刺激 BMP4 表达(Plt;0.05),在 pH4.0 条 件下效应明显增强(Plt;0.05)。 3.rhBMP4 呈浓度依赖抑制 EECs 增殖 (Plt;0.05)、降低细胞活力(Plt;0.05),可能与 BMP4 促细胞凋亡有 关。 4.正常
12、EECs 不表达肠化上皮标志物 Villin、CDX2 蛋白,rhBMP4 可呈 浓度依赖性促进细胞表达这两种蛋白(Plt;0.05)。 5.慢性酸暴露可明 显上调 EECs Villin 表达(Plt;0.05),BMP4 特异性拮抗剂 Noggin 可有效 抑制这种效应(Plt;0.05)。相对而言,短暂酸暴露对于 Villin 表达无影 响。 6.rhBMP4 可迅速活化 EECs 内 Smadl(Plt;0.05),并呈时间依赖性 增强 ID2 蛋白表达(Plt;0.05)。但撤去 rhBMP410 分钟后 P-Smadl 水平恢 复正常。 结论: 1.采用内镜下取材、改良消化方法、应
13、用完全 K-SFM 培 养基可成功进行人 EECs 的原代和传代培养,并克服了传统方法中所存在的细胞 来源受限、易受成纤维细胞污染、细胞数量稀少、细胞传代困难等问题。 2. 胃酸从基因转录及蛋白合成水平上刺激 EECs 表达.BMP4,并呈时间与浓度依赖 性。单独胆盐的作用较弱,在胃酸存在条件下作用增强。提示胃酸可能是导致 Barrett 食管发生最重要的环境因素,而胆盐则可能起到协同效应。 3.BMP4 可抑制 EECs 增殖,促进 EECs 表达肠化上皮标志物 Villin 和 CDX2。而 BMP4 拮 抗剂 Noggin 可有效抑制酸诱发的 EECs 表达 Villin 蛋白。提示 B
14、MP4 上调可能是食管上皮肠化生过程中的关键点。 4.BMP4 可有效激活 EECs 内 Smadl,并 促进 ID2 蛋白表达,提示 BMP4 通过激活胞内的 BMP 通路参与 BE 的发生。 背景和目的: Barrett 食管(BE)指食管下段鳞状上皮细胞被柱状上皮细胞 替代。大多数食管腺癌发生在 BE 基础上,而后者被认定为胃食管反流病(GERD) 的并发症。新近观点认为胃酸与胆盐是诱发具有遗传倾向患者发生 BE 的环境因 素,二者均可直接损伤食管粘膜上皮诱发 BE 发生,但具体分子发生机制尚不明 确。最近的研究发现 TGF- 家族中的 BMP4 可能参与这个过程,相对于正常食 管粘膜,
15、BMP4 在食管炎与 Barrett 食管粘膜中的表达明显上调,并可以诱导正 常食管鳞状上皮细胞细胞角蛋白表达发生变化。实验证明 BMP4 具有广泛的作用, 如诱导成骨、维持胚胎正常发育、诱导干细胞分化等等,但在 BE 表达上调的机 制及意义尚不清楚。为此本课题的研究目的是研究酸与胆盐对于正常食管鳞状 上皮细胞 BMP4 表达的影响,并探讨在食管上皮肠化生过程中 BMP4 所发挥的作 用及相关机制。 方法: 1.通过内镜检查下取材、改良消化酶、应用完全 KSFM 培养基探索简便易行的体外培养食管鳞状上皮细胞(EECs)的方法;2.采用 RT-PCR、real-time PCR、Westernb
16、lot 等方法,研究酸与胆盐对 EECs BMP4 基 因和蛋白表达的影响:3.采用细胞计数、Am-Blue 法检测重组人 BMP4(rhBMP4) 对于 EECs 增殖与活力的影响;4.采用 RT-PCR、real-time PCR、Western blot 等方法,检测 rhBMP4 诱导的 EECs Villin、CDX2 mRNA 与蛋白合成的变化,以 及 BMP4 特异性拮抗剂 Noggin 对于酸诱导 EECs 表达 Villin 蛋白效应的影响, 以明确 BMP4 诱导食管上皮肠化生的作用;5.采用 Western blot 的方法,检测 rhBMP4 对 EECs Smadl 活化水平和 ID2 蛋白表达水平的影响,以研究 BMP 信号 通路在 BMP4 诱导肠化生中的作用。 结果: 1.内镜下取材方法简便,并可 获得足够活细胞。TrypLETM Express 较胰酶纯度高,对细胞损伤小。原代培养