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1、生物化学与分子生物学专业优秀论文生物化学与分子生物学专业优秀论文 萝卜过氧化物酶基因萝卜过氧化物酶基因 RsPrx1RsPrx1在酵母中的表达、纯化及鉴定在酵母中的表达、纯化及鉴定关键词：心里美萝卜关键词：心里美萝卜 RsPrx1RsPrx1 重组表达载体重组表达载体 毕赤酵母毕赤酵母摘要：过氧化物酶在植物体内主要有两方面的作用，一方面与植物正常的形态 发生和建成有关，在植物的生长、发育过程中起作用；另一方面与植物的抗逆 性有关，包括抗旱、抗寒、抗盐和抗病等，是植物保护酶系中重要的保护酶之 一。本研究从成熟心里美萝卜肉质根的皮中提取总 RNA，采用 RT-PCR 方法得到 RsPrx1 的 c
2、DNA 片段，将其克隆到 pGEM-T 载体中，经测序鉴定为全长编码基因。 生物信息学研究表明 RsPrx1 的转录后加工符合典型的植物基因加工方式。之后 构建毕赤酵母重组表达载体 pPIC9KH-RsPrx1，测序表明 RsPrx1 正确插入 分 泌信号开放读码框的下游。将其转化毕赤酵母 GS115。转化后的酵母菌株经 MD 平板筛选后得到阳性重组子，将这些阳性克隆分别用诱导表达培养基 BMMY 诱导 表达，成功分泌表达出具有生物活性的外源过氧化物酶。 外源基因在毕赤酵 母中的表达受不同的培养条件影响，因此本研究对表达条件进行优化，得到重 组毕赤酵母表达 RsPrx1 的最佳发酵条件是：以
3、BMMY 和 BMGY 为发酵培养基，培 养基起始 pH 值为 7.4，甲醇浓度 0.5，温度 26，通气面积 1.5cm2：为快速 且高效地获得分泌表达的 RsPrx1 蛋白，采取更换培养基的方法，其间只须在达 到最大酶活时更换新鲜的诱导表达培养基，经过氧化物酶活性测定发现这种诱 导培养方法获得的总酶活是一般的连续培养(只添加 YP)的 2.59 倍；SDS-PAGE 分析表明诱导重组质粒表达了融合蛋白，分子量为 37KD，与氨基酸序列计算结 果一致；活性电泳检测表明重组毕赤酵母表达出来的是具有生物活性的 RsPrx1；分别用不同浓度的 NaCl 和 H2O2 处理重组毕赤酵母转化子，发现转
4、化 子具有一定的抗盐和抗氧化胁迫能力。本研究建立了 RsPrx1 的重组毕赤酵母表 达体系，建立了真核表达具有生物活性的外源过氧化物酶的有效方法，为进一 步研究外源 POD 的性质和功能奠定了基础。正文内容正文内容过氧化物酶在植物体内主要有两方面的作用，一方面与植物正常的形态发 生和建成有关，在植物的生长、发育过程中起作用；另一方面与植物的抗逆性 有关，包括抗旱、抗寒、抗盐和抗病等，是植物保护酶系中重要的保护酶之一。 本研究从成熟心里美萝卜肉质根的皮中提取总 RNA，采用 RT-PCR 方法得到 RsPrx1 的 cDNA 片段，将其克隆到 pGEM-T 载体中，经测序鉴定为全长编码基因。 生
5、物信息学研究表明 RsPrx1 的转录后加工符合典型的植物基因加工方式。之后 构建毕赤酵母重组表达载体 pPIC9KH-RsPrx1，测序表明 RsPrx1 正确插入 分 泌信号开放读码框的下游。将其转化毕赤酵母 GS115。转化后的酵母菌株经 MD 平板筛选后得到阳性重组子，将这些阳性克隆分别用诱导表达培养基 BMMY 诱导 表达，成功分泌表达出具有生物活性的外源过氧化物酶。 外源基因在毕赤酵 母中的表达受不同的培养条件影响，因此本研究对表达条件进行优化，得到重 组毕赤酵母表达 RsPrx1 的最佳发酵条件是：以 BMMY 和 BMGY 为发酵培养基，培 养基起始 pH 值为 7.4，甲醇浓
6、度 0.5，温度 26，通气面积 1.5cm2：为快速 且高效地获得分泌表达的 RsPrx1 蛋白，采取更换培养基的方法，其间只须在达 到最大酶活时更换新鲜的诱导表达培养基，经过氧化物酶活性测定发现这种诱 导培养方法获得的总酶活是一般的连续培养(只添加 YP)的 2.59 倍；SDS-PAGE 分析表明诱导重组质粒表达了融合蛋白，分子量为 37KD，与氨基酸序列计算结 果一致；活性电泳检测表明重组毕赤酵母表达出来的是具有生物活性的 RsPrx1；分别用不同浓度的 NaCl 和 H2O2 处理重组毕赤酵母转化子，发现转化 子具有一定的抗盐和抗氧化胁迫能力。本研究建立了 RsPrx1 的重组毕赤酵
7、母表 达体系，建立了真核表达具有生物活性的外源过氧化物酶的有效方法，为进一 步研究外源 POD 的性质和功能奠定了基础。 过氧化物酶在植物体内主要有两方面的作用，一方面与植物正常的形态发生和 建成有关，在植物的生长、发育过程中起作用；另一方面与植物的抗逆性有关， 包括抗旱、抗寒、抗盐和抗病等，是植物保护酶系中重要的保护酶之一。本研 究从成熟心里美萝卜肉质根的皮中提取总 RNA，采用 RT-PCR 方法得到 RsPrx1 的 cDNA 片段，将其克隆到 pGEM-T 载体中，经测序鉴定为全长编码基因。生物 信息学研究表明 RsPrx1 的转录后加工符合典型的植物基因加工方式。之后构建 毕赤酵母重
8、组表达载体 pPIC9KH-RsPrx1，测序表明 RsPrx1 正确插入 分泌信 号开放读码框的下游。将其转化毕赤酵母 GS115。转化后的酵母菌株经 MD 平板 筛选后得到阳性重组子，将这些阳性克隆分别用诱导表达培养基 BMMY 诱导表达， 成功分泌表达出具有生物活性的外源过氧化物酶。 外源基因在毕赤酵母中的 表达受不同的培养条件影响，因此本研究对表达条件进行优化，得到重组毕赤 酵母表达 RsPrx1 的最佳发酵条件是：以 BMMY 和 BMGY 为发酵培养基，培养基起 始 pH 值为 7.4，甲醇浓度 0.5，温度 26，通气面积 1.5cm2：为快速且高效 地获得分泌表达的 RsPrx
9、1 蛋白，采取更换培养基的方法，其间只须在达到最大 酶活时更换新鲜的诱导表达培养基，经过氧化物酶活性测定发现这种诱导培养 方法获得的总酶活是一般的连续培养(只添加 YP)的 2.59 倍；SDS-PAGE 分析表 明诱导重组质粒表达了融合蛋白，分子量为 37KD，与氨基酸序列计算结果一致； 活性电泳检测表明重组毕赤酵母表达出来的是具有生物活性的 RsPrx1；分别用 不同浓度的 NaCl 和 H2O2 处理重组毕赤酵母转化子，发现转化子具有一定的抗 盐和抗氧化胁迫能力。本研究建立了 RsPrx1 的重组毕赤酵母表达体系，建立了真核表达具有生物活性的外源过氧化物酶的有效方法，为进一步研究外源 P
10、OD 的性质和功能奠定了基础。 过氧化物酶在植物体内主要有两方面的作用，一方面与植物正常的形态发生和 建成有关，在植物的生长、发育过程中起作用；另一方面与植物的抗逆性有关， 包括抗旱、抗寒、抗盐和抗病等，是植物保护酶系中重要的保护酶之一。本研 究从成熟心里美萝卜肉质根的皮中提取总 RNA，采用 RT-PCR 方法得到 RsPrx1 的 cDNA 片段，将其克隆到 pGEM-T 载体中，经测序鉴定为全长编码基因。生物 信息学研究表明 RsPrx1 的转录后加工符合典型的植物基因加工方式。之后构建 毕赤酵母重组表达载体 pPIC9KH-RsPrx1，测序表明 RsPrx1 正确插入 分泌信 号开放
11、读码框的下游。将其转化毕赤酵母 GS115。转化后的酵母菌株经 MD 平板 筛选后得到阳性重组子，将这些阳性克隆分别用诱导表达培养基 BMMY 诱导表达， 成功分泌表达出具有生物活性的外源过氧化物酶。 外源基因在毕赤酵母中的 表达受不同的培养条件影响，因此本研究对表达条件进行优化，得到重组毕赤 酵母表达 RsPrx1 的最佳发酵条件是：以 BMMY 和 BMGY 为发酵培养基，培养基起 始 pH 值为 7.4，甲醇浓度 0.5，温度 26，通气面积 1.5cm2：为快速且高效 地获得分泌表达的 RsPrx1 蛋白，采取更换培养基的方法，其间只须在达到最大 酶活时更换新鲜的诱导表达培养基，经过氧
12、化物酶活性测定发现这种诱导培养 方法获得的总酶活是一般的连续培养(只添加 YP)的 2.59 倍；SDS-PAGE 分析表 明诱导重组质粒表达了融合蛋白，分子量为 37KD，与氨基酸序列计算结果一致； 活性电泳检测表明重组毕赤酵母表达出来的是具有生物活性的 RsPrx1；分别用 不同浓度的 NaCl 和 H2O2 处理重组毕赤酵母转化子，发现转化子具有一定的抗 盐和抗氧化胁迫能力。本研究建立了 RsPrx1 的重组毕赤酵母表达体系，建立了 真核表达具有生物活性的外源过氧化物酶的有效方法，为进一步研究外源 POD 的性质和功能奠定了基础。 过氧化物酶在植物体内主要有两方面的作用，一方面与植物正常
13、的形态发生和 建成有关，在植物的生长、发育过程中起作用；另一方面与植物的抗逆性有关， 包括抗旱、抗寒、抗盐和抗病等，是植物保护酶系中重要的保护酶之一。本研 究从成熟心里美萝卜肉质根的皮中提取总 RNA，采用 RT-PCR 方法得到 RsPrx1 的 cDNA 片段，将其克隆到 pGEM-T 载体中，经测序鉴定为全长编码基因。生物 信息学研究表明 RsPrx1 的转录后加工符合典型的植物基因加工方式。之后构建 毕赤酵母重组表达载体 pPIC9KH-RsPrx1，测序表明 RsPrx1 正确插入 分泌信 号开放读码框的下游。将其转化毕赤酵母 GS115。转化后的酵母菌株经 MD 平板 筛选后得到阳
14、性重组子，将这些阳性克隆分别用诱导表达培养基 BMMY 诱导表达， 成功分泌表达出具有生物活性的外源过氧化物酶。 外源基因在毕赤酵母中的 表达受不同的培养条件影响，因此本研究对表达条件进行优化，得到重组毕赤 酵母表达 RsPrx1 的最佳发酵条件是：以 BMMY 和 BMGY 为发酵培养基，培养基起 始 pH 值为 7.4，甲醇浓度 0.5，温度 26，通气面积 1.5cm2：为快速且高效 地获得分泌表达的 RsPrx1 蛋白，采取更换培养基的方法，其间只须在达到最大 酶活时更换新鲜的诱导表达培养基，经过氧化物酶活性测定发现这种诱导培养 方法获得的总酶活是一般的连续培养(只添加 YP)的 2.
15、59 倍；SDS-PAGE 分析表 明诱导重组质粒表达了融合蛋白，分子量为 37KD，与氨基酸序列计算结果一致； 活性电泳检测表明重组毕赤酵母表达出来的是具有生物活性的 RsPrx1；分别用 不同浓度的 NaCl 和 H2O2 处理重组毕赤酵母转化子，发现转化子具有一定的抗 盐和抗氧化胁迫能力。本研究建立了 RsPrx1 的重组毕赤酵母表达体系，建立了真核表达具有生物活性的外源过氧化物酶的有效方法，为进一步研究外源 POD 的性质和功能奠定了基础。 过氧化物酶在植物体内主要有两方面的作用，一方面与植物正常的形态发生和 建成有关，在植物的生长、发育过程中起作用；另一方面与植物的抗逆性有关， 包括
16、抗旱、抗寒、抗盐和抗病等，是植物保护酶系中重要的保护酶之一。本研 究从成熟心里美萝卜肉质根的皮中提取总 RNA，采用 RT-PCR 方法得到 RsPrx1 的 cDNA 片段，将其克隆到 pGEM-T 载体中，经测序鉴定为全长编码基因。生物 信息学研究表明 RsPrx1 的转录后加工符合典型的植物基因加工方式。之后构建 毕赤酵母重组表达载体 pPIC9KH-RsPrx1，测序表明 RsPrx1 正确插入 分泌信 号开放读码框的下游。将其转化毕赤酵母 GS115。转化后的酵母菌株经 MD 平板 筛选后得到阳性重组子，将这些阳性克隆分别用诱导表达培养基 BMMY 诱导表达， 成功分泌表达出具有生物活性的外源过氧化物酶。 外源基因在毕赤酵母中的 表达受不同的培养条件影响，因此本研究对表达条件进行优化，得到重组毕赤 酵母表达 RsPrx1 的最佳发酵条件是：以 BMMY 和 BMGY 为发酵培养基，培养基起 始 pH 值为 7.4，甲醇浓度 0.5，温度 26，通气面积 1.5cm2：为快速且高效 地获得分泌表
