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1、临床兽医学专业优秀论文临床兽医学专业优秀论文 脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒性和生物转化的脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒性和生物转化的研究研究关键词：脱氧雪腐镰刀菌烯醇关键词：脱氧雪腐镰刀菌烯醇 生物转化生物转化 转化效果转化效果 真菌毒素真菌毒素 禾谷镰刀菌禾谷镰刀菌摘要：真菌毒素是由真菌或霉菌产生的有毒次级代谢产物，广泛污染各种饲料 原料和成品饲料。动物食入被真菌毒素污染的饲料会造成动物的真菌毒素中毒。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是禾谷镰刀菌在生长的过程中产生的一种主要代 谢产物，是单端孢霉烯族毒素中的一种，广泛污染各种谷物和饲料。 本论文 主要研究在常规污染剂量下 DON 对小鼠的毒性和对其生物转化方发法。
2、 试验 脱氧雪腐镰刀菌烯醇对小鼠的生长性能、血液生化和组织病理学的影响。 昆明小鼠 40 只，分为 4 组，每组 10 只，雌雄各半，分别饲喂 1mg kglt;#39;1gt;DON+基础日粮(1mgDON 组)、 3mgkglt;#39;-1gt; DON+基础日粮(3mgDON 组)、5mg kglt;#39;-1gt;DON+基础日粮饲料(5mgDON 纽)和基础日粮(对 照组)。饲喂 20 天后分别测定生长性能、血清生化、血常规和免疫器官的重量 (胸腺，脾脏)等指标，并且观察肝脏、脾脏、十二指肠、胃、肾脏和胸腺的病 理变化。结果表明 5mg DON 组在增重、饲料转化率、免疫器官的重
3、量(胸腺，脾 脏)、红细胞计数、平均红细胞体积和血小板计数等方面与对照组相比差异显著； 而 1mg DON 组和 3mg DON 组与对照组相比差异均不显著。在生化方面，5mg DON 组血清中的总蛋白、球蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、尿素氮、 肌酐、甘油三酯等方面与对照组相比较差异显著。5mg DON 组的组织器官的病 理变化主要表现为：肝脏的淤血、凋亡细胞增加、细胞间的界限不明显、部分 细胞核消失和部分肝细胞肿胀；脾脏被膜增厚、脾小梁增生、部分脾细胞变性 坏死、脾脏淤血；胸腺的局部出血；胃绒毛的萎缩和局部出血；十二指肠肠绒 毛萎缩或脱落；心肌萎缩、心肌变性、心肌细胞肿胀和肾脏髓
4、质出血、肾小球 内有浸出物和部分上皮细胞变性等。 试验脱氧雪腐镰刀烯醇对 CHO-K1 和 HL-7702 细胞系的细胞毒性在培养基中加入不同浓度 DON(DON 终浓度分别为 0ng mLlt;#39;-1gt;，100ng mlt;#39;- 1gt;，200ng mLlt;#39;-1gt;，400ng mLlt;#39;-1gt;，800ng mLlt;#39;-1gt;)， 分别用 MTT 法测定 DON 对中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)和人肝细胞(HL-7702)的毒 性作用，用放射免疫法测定细胞上清液中的白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6) 和肿瘤坏死因子-(TNF-
5、)的浓度。结果表明在低浓度时 DON 对细胞上清液中 (100200 ng mLlt;#39;-1gt;)IL-2、IL-6 和 TNF- 的浓度 没有明显的抑制作用，但是在高浓度(400800 ng mLlt;#39;- 1gt;)时，却抑制了它们的表达。通过 MTT 法测得 CHO-K1 和 HL-7702 的半 抑制浓度(IClt;,50gt;)分别为 123.5ng mLlt;#39;- 1gt;和 336.2 ng mLlt;#39;-1gt;。同时在高浓度 (400800 ng mLlt;#39;-1gt;)时能明显抑制 CHO-K1 和 HL- 7702 的生长。试验脱氧雪腐镰刀
6、茵烯醇生物转化茵的分离和鉴定以脱氧雪腐 镰刀茵烯醇(DON)为唯一碳源，通过富集培养从土壤中分离到一株可以生物转化 DON 的真菌，编号为 NJA-1。用真菌通用引物 ITS1 和 ITS4 扩增了该菌的 ITS 区间，包括 ITS1 和 ITS2，扩增片段大小为 565bp，通过在 GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 数据库上比较将该菌鉴定了属，然后用种间引物 Bt2a 和 Bt2b 扩增了该菌的 -tubulin 基因序列，扩增片段大小为 511pb。通过 ITS 和 -tubulin 基因序列分析和形态学观察最终鉴定该菌株为塔宾曲霉。该菌的 -tubulin 基因序列在 GenB
7、ank+EMBL+DDBJ+PDB 的登录号为 DQ902579，其与塔 宾曲霉 AY820009 的相似性为 99。 试验 NJA-1 菌的体外生物转化和转化 产物的检测把 NJA-1 加入含有不同浓度 DON 的无机盐培养基中，在 30， 120r minlt;#39;-1gt;，振荡培养 14d 后，可以转化 94.4 的 DON。最高浓度达到 40mg Llt;#39;-1gt;。分别用薄层层析 (TLC)，高效液相色谱(HPLC)和高效液相色谱一质谱联用(HPLC-MS)对 DON 的生 物转化产物进行了检测。结果表明在 365nm 紫外灯下检测可见其具有荧光。 HPLC 检测其既有
8、紫外吸收(波长：218nm)和荧光吸收(Ex=340，Em=450)。HPLC- MS 检测其转化产物的相对分子量为 314.4，其分子量比 DON 大 18.1，证明 NJA- 1 可以水解 DON。 试验生物转化茵 NJA-1 对饲料中 DON 的转化效果昆明小 鼠 40 只，分为 4 组，每组 10 只，雌雄各半，分别饲喂基础日粮(对照组)5mg kg lt;#39;1gt;DON+5g kg lt;#39;1gt;NJA- 1 菌(菌+DON 组)、5mg kglt;#39;-1gt;DON+基础日粮(5mgDON 组)、5g kg lt;#39;1gt;NJA-1 菌+基础日粮饲料(
9、菌组)和。 饲喂 20 天后分别测定生长性能、血清生化、血常规和免疫器官的重量(胸腺， 脾脏)等指标，并且观察肝脏、脾脏、十二指肠、胃、肾脏和胸腺的病理变化。 试验结果表明在饲料添加 5g kglt;#39;-1gt;的 NJA-1 菌能减 少 DON 引起的毒性作用。同时在饲料中添加 5g kglt;#39;- 1gt;的 NJA-1 茵没有对昆明小鼠造成明显的副作用，该试验为 NJA-1 菌的 进一步应用研究奠定了基础。正文内容正文内容真菌毒素是由真菌或霉菌产生的有毒次级代谢产物，广泛污染各种饲料原 料和成品饲料。动物食入被真菌毒素污染的饲料会造成动物的真菌毒素中毒。 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(
10、DON)是禾谷镰刀菌在生长的过程中产生的一种主要代谢产 物，是单端孢霉烯族毒素中的一种，广泛污染各种谷物和饲料。 本论文主要 研究在常规污染剂量下 DON 对小鼠的毒性和对其生物转化方发法。 试验脱 氧雪腐镰刀菌烯醇对小鼠的生长性能、血液生化和组织病理学的影响。 昆明 小鼠 40 只，分为 4 组，每组 10 只，雌雄各半，分别饲喂 1mg kglt;#39;1gt;DON+基础日粮(1mgDON 组)、 3mgkglt;#39;-1gt; DON+基础日粮(3mgDON 组)、5mg kglt;#39;-1gt;DON+基础日粮饲料(5mgDON 纽)和基础日粮(对 照组)。饲喂 20 天后
11、分别测定生长性能、血清生化、血常规和免疫器官的重量 (胸腺，脾脏)等指标，并且观察肝脏、脾脏、十二指肠、胃、肾脏和胸腺的病 理变化。结果表明 5mg DON 组在增重、饲料转化率、免疫器官的重量(胸腺，脾 脏)、红细胞计数、平均红细胞体积和血小板计数等方面与对照组相比差异显著； 而 1mg DON 组和 3mg DON 组与对照组相比差异均不显著。在生化方面，5mg DON 组血清中的总蛋白、球蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、尿素氮、 肌酐、甘油三酯等方面与对照组相比较差异显著。5mg DON 组的组织器官的病 理变化主要表现为：肝脏的淤血、凋亡细胞增加、细胞间的界限不明显、部分 细
12、胞核消失和部分肝细胞肿胀；脾脏被膜增厚、脾小梁增生、部分脾细胞变性 坏死、脾脏淤血；胸腺的局部出血；胃绒毛的萎缩和局部出血；十二指肠肠绒 毛萎缩或脱落；心肌萎缩、心肌变性、心肌细胞肿胀和肾脏髓质出血、肾小球 内有浸出物和部分上皮细胞变性等。 试验脱氧雪腐镰刀烯醇对 CHO-K1 和 HL-7702 细胞系的细胞毒性在培养基中加入不同浓度 DON(DON 终浓度分别为 0ng mLlt;#39;-1gt;，100ng mlt;#39;- 1gt;，200ng mLlt;#39;-1gt;，400ng mLlt;#39;-1gt;，800ng mLlt;#39;-1gt;)， 分别用 MTT 法测
13、定 DON 对中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)和人肝细胞(HL-7702)的毒 性作用，用放射免疫法测定细胞上清液中的白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6) 和肿瘤坏死因子-(TNF-)的浓度。结果表明在低浓度时 DON 对细胞上清液中 (100200 ng mLlt;#39;-1gt;)IL-2、IL-6 和 TNF- 的浓度 没有明显的抑制作用，但是在高浓度(400800 ng mLlt;#39;- 1gt;)时，却抑制了它们的表达。通过 MTT 法测得 CHO-K1 和 HL-7702 的半 抑制浓度(IClt;,50gt;)分别为 123.5ng mLlt;#39;- 1gt;
14、和 336.2 ng mLlt;#39;-1gt;。同时在高浓度 (400800 ng mLlt;#39;-1gt;)时能明显抑制 CHO-K1 和 HL- 7702 的生长。试验脱氧雪腐镰刀茵烯醇生物转化茵的分离和鉴定以脱氧雪腐 镰刀茵烯醇(DON)为唯一碳源，通过富集培养从土壤中分离到一株可以生物转化 DON 的真菌，编号为 NJA-1。用真菌通用引物 ITS1 和 ITS4 扩增了该菌的 ITS 区 间，包括 ITS1 和 ITS2，扩增片段大小为 565bp，通过在 GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 数据库上比较将该菌鉴定了属，然后用种间引物 Bt2a 和 Bt2b 扩增了该
15、菌的 -tubulin 基因序列，扩增片段大小为 511pb。通过 ITS 和 -tubulin 基因序列分析和形态学观察最终鉴定该菌株为塔宾曲霉。该菌的-tubulin 基因序列在 GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 的登录号为 DQ902579，其与塔 宾曲霉 AY820009 的相似性为 99。 试验 NJA-1 菌的体外生物转化和转化 产物的检测把 NJA-1 加入含有不同浓度 DON 的无机盐培养基中，在 30， 120r minlt;#39;-1gt;，振荡培养 14d 后，可以转化 94.4 的 DON。最高浓度达到 40mg Llt;#39;-1gt;。分别用薄层层析
16、(TLC)，高效液相色谱(HPLC)和高效液相色谱一质谱联用(HPLC-MS)对 DON 的生 物转化产物进行了检测。结果表明在 365nm 紫外灯下检测可见其具有荧光。 HPLC 检测其既有紫外吸收(波长：218nm)和荧光吸收(Ex=340，Em=450)。HPLC- MS 检测其转化产物的相对分子量为 314.4，其分子量比 DON 大 18.1，证明 NJA- 1 可以水解 DON。 试验生物转化茵 NJA-1 对饲料中 DON 的转化效果昆明小 鼠 40 只，分为 4 组，每组 10 只，雌雄各半，分别饲喂基础日粮(对照组)5mg kg lt;#39;1gt;DON+5g kg lt;#39;1gt;NJA- 1 菌(菌+DON 组)、5mg kglt;#39;-1gt;DON+基础日粮(5mgDON 组)、5g kg lt;#39;1gt;NJA-1 菌+基础日粮饲料(菌组)和。 饲喂 20 天后分别测定生长性能、
