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1、神经生物学专业优秀论文神经生物学专业优秀论文 GM1GM1、神经营养因子和骨骼肌对、神经营养因子和骨骼肌对 DRGDRG 神经神经元表型影响的实验研究元表型影响的实验研究关键词：单涎性神经节苷脂关键词：单涎性神经节苷脂 骨骼肌骨骼肌 神经生长因子神经生长因子 脑源性神经营养因子脑源性神经营养因子 背根背根 神经节神经节 神经元表型神经元表型摘要：神经肽免疫反应（neuropeptide-immunoreactive，NP-IR）神经元和神 经丝免疫反应（neurofilament-immunoreactive，NF-IR）神经元是背根神经节 （dorsal root ganglion，DRG）
2、神经元的两个主要表型。NP-IR 神经元周围突 属于无髓或薄髓纤维，分布于内脏和皮肤，可以合成并释放 P 物质（substance P， SP）等生物活性物质。NF-IR 神经元周围突则属于有髓纤维，分布于肌梭， 主要参与牵张反射刺激，与本体感觉的信息传递有关。SP 是 DRG 神经元内的神 经递质，在神经元的胞体内合成，经轴突运输至神经末梢，在炎症、应激等刺 激下释放，发挥生物学效应。神经丝是神经元细胞骨架结构的一个重要组成部 分，参与维持神经元正常的形态结构。神经丝主要有轻（NF-L） 、中（NF-M） 、 重（NF-H）三种亚型，其分子量分别为 68 kDa，160 kDa 和 200
3、kDa。神经丝- 200（neurofilament200，NF-200）是构成轴突的主要骨架结构，在 DRG 神经元 发育过程中有表达，是 NF-IR 神经元表型的一个重要指标。 单涎性神经节苷 脂（monosiaganglioside， GM1）在神经元的发育，分化和存活等生理状态和 病理状态下均具有营养作用。体内与体外实验皆表明，GM1 可以发挥神经营养 因子样作用。体外实验表明，神经元诱导分化过程中伴随着 GM1 生物合成的改 变和核膜 GM1 含量的增高。 神经营养因子（neurotrophins，NTs）在周围神 经系统的发育和存活中具有重要的调节作用。神经生长因子（nerve g
4、rowth factor， NGF） 、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor， BDNF）和神经营养素-3（neurotrophin-3，NT-3）都是 NTs 家族的成 员。研究表明，外源性应用这些营养因子可以保护受损神经元，刺激轴突再生。NGF 在感觉神经元的发育过程中，对于初级传入神经元的存活和表型的形 成具有重要的影响作用。体外培养成年 DRG 感觉神经元发现，部分 DRG 感觉神 经元的神经肽表型是固有的，并且其表犁的表达程度可以由 NGF 来调节。在 DRG 神经元受损时，NGF 还可以逆转具有高亲和力 NGF 受体的 DRG 神经
5、元中神经 丝 mRNA 的减少。 BDNF 在中枢和周围神经系统的发育过程中起着重要的作 用，可以调节神经元的存活、生长和分化。在 DRG 感觉神经元中，BDNF 主要存 在于小型和中型亚群 DRG 感觉神经元，可以顺向转运至神经元的周围突和中枢 突。体内实验表明，BDNF 的存在对于 DRG 感觉神经元的存活和功能的维持具有 非常重要的作用。体外实验也表明，部分感觉神经元的存活依赖于 BDNF 的存在。NT-3 可作为促细胞分裂因子或诱导神经元分化的因子，维持胚胎发育中神 经元的存活，并促进其分化与增殖。NT-3 在感觉神经元和交感神经元的存活和 分化，以及神经突起发生、突触形成和轴突生长中
6、均具有非常重要的作用。研 究发现，DRG 感觉神经元可能是脊髓神经营养因子如 NT-3 的来源之一，并且在 脊髓损伤后 DRG 感觉神经元内的 NT-3 可以顺行转运至脊髓，有利于脊髓神经元 的再生。 靶组织在维持神经元的功能和神经-肌间的信息传递中，发挥着重 要作用。运动神经元与其支配的骨骼肌（skeletal muscle，SKM）之间具有密 切的相互依赖关系。两种组织之间的重要信息传递是由神经-肌接头（neuromuscular junction，NMJ）介导的。在这两种组织的其它部位释放和接 收各种因子也是它们之间相互影响的一种方式。神经.肌之间的信息传递之一是 神经营养因子和其他分子
7、的相互交换。体外实验发现，新生哺乳动物 NF-IR 阳 性 DRG 神经元，需要 SKM 提取物中的一种神经营养因子来维持其存活。实验表 明，在神经元的发育过程中，靶源性神经营养因子对于支配肌细胞的不同神经 元的存活和分化具有重要的生物学作用。感觉神经末梢可以为去神经支配肌组 织提供神经营养因子，SKM 的肌梭也受 DRG 感觉神经元支配。 GM1、NGF、BDNF、NT-3 和靶组织 SKM 对维持神经元的功能都发挥重要的作用。 然而，GM1、NGF、BDNF、NT-3 单独应用或与靶组织 SKM 联合应用是否影响 DRG 感觉神经元的表型目前尚不清楚。基于以上研究背景，本研究在体外建立 D
8、RG 神经元单纯培养和 DRG 神经元与 SKM 细胞联合培养的细胞模型，通过检测体外 培养的 DRG 神经元中 SP-IR 和 NF-200-IR 神经元的表达情况，来分析 GMI、NGF、BDNF、NT-3 和 SKM 细胞单独应用以及 GM1、NGF、BDNF、NT-3 分别 与 SKM 细胞联合应用对 DRG 神经元表型的影响作用，为初级传入神经元表型变 化的发育神经生物学提供新的理论和实验依据。 第一部分 GM1 和骨骼肌对培 养的 DRG 神经元表型的影响作用 胚胎第 12.5 天（embryonic day12.5，E12.5）和胚胎第 19.5 天（embryonic day1
9、9.5，E19.5）的大鼠 DRG 神经元，分别进行体外单纯分散培养以及与 SKM 细胞的联合培养，体外培养 2d 后，分为 8 组。 （1）E12.5 对照组：E12.5DRG 神经元单纯培养，不施加任何干 预因素，继续在培养液内培养 4d；（2）E19.5 对照组：E19.5DRG 神经元单纯 培养，不施加任何干预因素，继续在培养液内培养 4 d；（3）E12.5GM1 组： E12.5DRG 神经元单纯培养，用 GM1（终浓度 10g/ml）孵育 4 d；（4） E19.5GM1 组：E19.5DRG 神经元单纯培养，用 GM1（终浓度 10g/ml）孵育 4 d；（5）E12.5SKM
10、 组：E12.5DRG 神经元与 SKM 细胞联合培养，不施加任何干预 因素，继续培养 4 d；（6）E19.5SKM 组：E19.5DRG 神经元与 SKM 细胞联合培 养，不施加任何干预因素，继续培养 4 d：（7）E12.5GM1+SKM 组：E12.5DRG 神经元与 SKM 细胞联合培养，用 GM1（终浓度 10g/ml）孵育 4 d；（8） E19.5GM1+SKM 组：E19.5DRG 神经元与 SKM 细胞联合培养，用 GMI（终浓度 10g/ml）孵育 4d。在培养过程中，用倒置相差显微镜动态观察各组标本在不 同时间的生长状态。终止培养后，用扫描电子显微镜观察单纯培养中 DR
11、G 神经 元胞体、突起及神经末梢的形态以及联合培养中 DRG 神经元胞体、突起的形态 以及神经末梢与 SKM 之间的关系；用免疫荧光双标技术来检测单纯培养和联合 培养中 DRG 神经元中 SP-IR 和 NF-200-IR 神经元的表达变化。 实验结果如下：（1）倒置相差显微镜和扫描电子显微镜观察发现，DRG 神经元的突起跨过 SKM 细胞或者到达并分布于 SKM 细胞表面，在 SKM 细胞自发性收缩的牵动下， DRG 神经元的突起也随之移动。 （2）GM1 可以促进体外分散培养的 E12.5DRG 神经元中 SP 和 NF-200 的表达（Plt;0.05） ，而不能促进体外分散培养的 E1
12、9.5DRG 神经元中 SP 和 NF-200 的表达。 （3）靶组织 SKM 细胞可以促进体 外培养的 E12.5 DRG 神经元中 NF-200 的表达（Plt;0.05）而不能促进 SP 的表达；靶组织 SKM 细胞对体外培养的 E19.5DRG 神经元中 SP 和 NF-200 的表达 无影响作用。 （4）GM1 和靶组织 SKM 细胞对促进 E12.5DRG 神经元 SP 和 NF- 200 的表达具有协同作用（Plt;0.001） ；而 GM1 和靶组织 SKM 细胞对 E19.5DRG 神经元 SP 和 NF-200 的表达无影响作用。 第二部分神经营养因子 和骨骼肌对培养的 D
13、RG 神经元表型的影响作用 体外培养的 DRG 神经元取自Wistar 大鼠第 12.5 d 的胚胎。无菌条件下进行体外 DRG 神经元单纯培养以及 与 SKM 细胞的体外联合培养，体外培养 2d 后，分为 8 组。 （1）对照组：单纯培 养的胎鼠 DRG 神经元，不施加任何干预因素，继续在培养液内培养 4d；（2） NGF 组：单纯培养的胎鼠 DRG 神经元，用 NGF（10 ng/ml）孵育 4d；（3）BDNF 组：单纯培养的胎鼠 DRG 神经元，用 BDNF（10 ng/ml）孵育 4d；（4）NT-3 组： 单纯培养的胎鼠 DRG 神经元，用 NT-3（10 ng/ml）孵育 4d；
14、（5）SKM 组：胎 鼠 DRG 神经元与 SKM 细胞联合培养，不施加任何干预因素，继续在培养液内培 养 4 d；（6）SKM+NGF 组：胎鼠 DRG 神经元与 SKM 细胞联合培养，用 NGF（10 ng/ml）孵育 4 d；（7）SKM+BDNF 组：胎鼠 DRG 神经元与 SKM 细胞联合培养， 用 BDNF（10 ng/ml）孵育 4 d；（8）SKM+NT-3 组：胎鼠 DRG 神经元与 SKM 细 胞联合培养，用 NT-3（10 ng/ml）孵育 4d。在培养过程中，用倒置相差显微镜 动态观察各组标本在不同时间的生长状态。终止培养后，用免疫荧光双标技术 检测单纯和联合培养中 D
15、RG 神经元 SP-IR 和 NF-200-IR 神经元表达的比例，用 Western blot 技术检测联合培养标本中 SP 和 NF-200 蛋白的表达。正文内容正文内容神经肽免疫反应（neuropeptide-immunoreactive，NP-IR）神经元和神经 丝免疫反应（neurofilament-immunoreactive，NF-IR）神经元是背根神经节 （dorsal root ganglion，DRG）神经元的两个主要表型。NP-IR 神经元周围突 属于无髓或薄髓纤维，分布于内脏和皮肤，可以合成并释放 P 物质（substance P， SP）等生物活性物质。NF-IR 神
16、经元周围突则属于有髓纤维，分布于肌梭， 主要参与牵张反射刺激，与本体感觉的信息传递有关。SP 是 DRG 神经元内的神 经递质，在神经元的胞体内合成，经轴突运输至神经末梢，在炎症、应激等刺 激下释放，发挥生物学效应。神经丝是神经元细胞骨架结构的一个重要组成部 分，参与维持神经元正常的形态结构。神经丝主要有轻（NF-L） 、中（NF-M） 、 重（NF-H）三种亚型，其分子量分别为 68 kDa，160 kDa 和 200 kDa。神经丝- 200（neurofilament200，NF-200）是构成轴突的主要骨架结构，在 DRG 神经元 发育过程中有表达，是 NF-IR 神经元表型的一个重要指标。 单涎性神经节苷 脂（monosiaganglioside， GM1）在神经元的发育，分化和存活等生理状态和 病理状态下均具有营养作用。体内与体外实验皆表明，GM1 可以发挥神经营养 因子样作用。体外实验表明，神经元诱导分化过程中伴随着 GM1 生物合成的改 变和核膜 GM1 含量的增高。 神经
