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1、遗传学专业优秀论文遗传学专业优秀论文 甘蓝型油菜中可能与甘蓝型油菜中可能与 ATPATP 6 6 相互作用的基因相互作用的基因的克隆及真核表达载体的构建的克隆及真核表达载体的构建关键词：油菜雄性不育关键词：油菜雄性不育 染色体步移染色体步移 水解酶水解酶 甘蓝型油菜甘蓝型油菜 基因克隆基因克隆 真核表达载真核表达载 体体摘要：细胞质雄性不育和核控制的育性恢复是广泛存在于植物中的生理现象。 细胞质雄性不育不仅是研究细胞核基因和细胞质基因相互作用的的重要材料， 而且该现象在杂种优势的利用中有着十分重要的作用。因此，研究哪些与细胞 质雄性不育有关的基因，利用基因工程的方法创造雄性不育系，在杂交中的生
2、 产中具有重要的意义。 甘蓝型油菜是世界上广泛种植一种重要的油料作物， 其杂种优势比较明显，因此把雄性不育应用于杂交种的生产具有重大的意义。 目前，人们对于甘蓝型油菜雄性不育的研究主要集中于萝卜胞质不育，波里马 胞质不育和 nap 胞质不育。波里马细胞质雄性不育因其不育性稳定，容易找到 恢复基因，此不育系被认为在杂交中的生产中是最有优势的。 甘蓝型油菜波 利马(Brassica napus pol)细胞质雄性不育系因其不育性稳定，容易找到恢 复基因，被认为是一种很有实用价值的油菜胞质不育类型。目前关于其分子机 制的研究已证实，线粒体 ATP 合成酶的一个亚基 ATP 6 与其雄性不育相关。 以
3、与甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育有关的 atp 6 基因编码的 ATP 6 作为诱 饵蛋白，通过酵母双杂交技术，筛选与其相互作用的蛋白质，并克隆出其编码 序列。 本试验对其中的一个筛选结果进行研究。测序结果表明，由酵母双杂 交所筛选到的序列只是基因的 3端序列，并不是基因的完整序列。在此已知 片段的基础上，我们利用 cDNA 末端快速扩增(RACE)的方法对基因的 5#39;端 cDNA 进行扩增，测序后 blast 的比对结果表明，只是基因的部分序列，并没有 扩增到基因全长序列。根据 RACE 的测序结果，设计引物，通过染色体步移的方 法进行基因的克隆。测序后，将酵母双杂交的测序结果，RAC
4、E 的测序结果，以 及染色体步移的测序结果进行序列拼接，根据拼接所得到的全长序列设计引物： 359-Up-primer： 5#39;-ATG ATG GAT ACT TTC CCT CCT TCG- 3#39;：359-Down-primer.5#39;-TCA CCA GAA GGG TAA CAA AAC ACA AG-3#39;，分别以油菜的总基因组 DNA 和反转的 cDNA 作为模板，进 行基因全长的扩增，连接到 pMD18-T 载体。测序结果分析表明，此基因的 DNA 全长为 1172bp，cDNA 全长为 1011bp，内含子长 161bp，分为两段序列，其长度 分别为 79bp
5、 和 82bp。在 NCBI 上进行比对分析，此基因含有水解酶家族十七的 保守结构域，该基因与拟南芥的编码未知蛋白的基因(GeneBank 登录号为 AA042272.1)同源性达 88，与拟南芥的推定的葡聚糖内切-1，3-beta-葡萄糖 酶 1 前体(GeneBank 登录号为 065539)的同源性为 88。利用网站和多种生物 学软件对推导出的氨基酸序列进行分析。分析结果表明，此氨基酸序列有以下 特征：(1)无信号肽序列：(2)有两个跨膜结构域。 由于在油菜中还未见有此 基因序列的报道，其在油菜中的功能也是未知的。因此对该基因进行了载体的 构建。先用 Pst /BamH 酶切含有目标序列
6、的 T 载体，连接到 pBlueseript SK 中间载体上面，再分别用 EcoR V/BamH 、EcoR V/Xba 酶切中间载体， 连接到真核表达载体上面。目前，已成功地把此基因构建到植物真核表达载体 pCAMBIA 2301G 中，准备通过农杆菌浸染途径，转入甘蓝型油菜对目标基因进行过量表达和抑制表达。通过分析转基因油菜育性的变化，来揭示这个基因和 甘蓝型油菜雄性不育的关系。正文内容正文内容细胞质雄性不育和核控制的育性恢复是广泛存在于植物中的生理现象。细 胞质雄性不育不仅是研究细胞核基因和细胞质基因相互作用的的重要材料，而 且该现象在杂种优势的利用中有着十分重要的作用。因此，研究哪些
7、与细胞质 雄性不育有关的基因，利用基因工程的方法创造雄性不育系，在杂交中的生产 中具有重要的意义。 甘蓝型油菜是世界上广泛种植一种重要的油料作物，其 杂种优势比较明显，因此把雄性不育应用于杂交种的生产具有重大的意义。目 前，人们对于甘蓝型油菜雄性不育的研究主要集中于萝卜胞质不育，波里马胞 质不育和 nap 胞质不育。波里马细胞质雄性不育因其不育性稳定，容易找到恢 复基因，此不育系被认为在杂交中的生产中是最有优势的。 甘蓝型油菜波利 马(Brassica napus pol)细胞质雄性不育系因其不育性稳定，容易找到恢复 基因，被认为是一种很有实用价值的油菜胞质不育类型。目前关于其分子机制 的研究
8、已证实，线粒体 ATP 合成酶的一个亚基 ATP 6 与其雄性不育相关。 以 与甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育有关的 atp 6 基因编码的 ATP 6 作为诱饵 蛋白，通过酵母双杂交技术，筛选与其相互作用的蛋白质，并克隆出其编码序 列。 本试验对其中的一个筛选结果进行研究。测序结果表明，由酵母双杂交 所筛选到的序列只是基因的 3端序列，并不是基因的完整序列。在此已知片 段的基础上，我们利用 cDNA 末端快速扩增(RACE)的方法对基因的 5#39; 端 cDNA 进行扩增，测序后 blast 的比对结果表明，只是基因的部分序列，并没 有扩增到基因全长序列。根据 RACE 的测序结果，设计引
9、物，通过染色体步移的 方法进行基因的克隆。测序后，将酵母双杂交的测序结果，RACE 的测序结果， 以及染色体步移的测序结果进行序列拼接，根据拼接所得到的全长序列设计引 物：359-Up-primer： 5#39;-ATG ATG GAT ACT TTC CCT CCT TCG- 3#39;：359-Down-primer.5#39;-TCA CCA GAA GGG TAA CAA AAC ACA AG-3#39;，分别以油菜的总基因组 DNA 和反转的 cDNA 作为模板，进 行基因全长的扩增，连接到 pMD18-T 载体。测序结果分析表明，此基因的 DNA 全长为 1172bp，cDNA 全
10、长为 1011bp，内含子长 161bp，分为两段序列，其长度 分别为 79bp 和 82bp。在 NCBI 上进行比对分析，此基因含有水解酶家族十七的 保守结构域，该基因与拟南芥的编码未知蛋白的基因(GeneBank 登录号为 AA042272.1)同源性达 88，与拟南芥的推定的葡聚糖内切-1，3-beta-葡萄糖 酶 1 前体(GeneBank 登录号为 065539)的同源性为 88。利用网站和多种生物 学软件对推导出的氨基酸序列进行分析。分析结果表明，此氨基酸序列有以下 特征：(1)无信号肽序列：(2)有两个跨膜结构域。 由于在油菜中还未见有此 基因序列的报道，其在油菜中的功能也是未
11、知的。因此对该基因进行了载体的 构建。先用 Pst /BamH 酶切含有目标序列的 T 载体，连接到 pBlueseript SK 中间载体上面，再分别用 EcoR V/BamH 、EcoR V/Xba 酶切中间载体， 连接到真核表达载体上面。目前，已成功地把此基因构建到植物真核表达载体 pCAMBIA 2301G 中，准备通过农杆菌浸染途径，转入甘蓝型油菜对目标基因进 行过量表达和抑制表达。通过分析转基因油菜育性的变化，来揭示这个基因和 甘蓝型油菜雄性不育的关系。 细胞质雄性不育和核控制的育性恢复是广泛存在于植物中的生理现象。细胞质 雄性不育不仅是研究细胞核基因和细胞质基因相互作用的的重要材
12、料，而且该 现象在杂种优势的利用中有着十分重要的作用。因此，研究哪些与细胞质雄性不育有关的基因，利用基因工程的方法创造雄性不育系，在杂交中的生产中具 有重要的意义。 甘蓝型油菜是世界上广泛种植一种重要的油料作物，其杂种 优势比较明显，因此把雄性不育应用于杂交种的生产具有重大的意义。目前， 人们对于甘蓝型油菜雄性不育的研究主要集中于萝卜胞质不育，波里马胞质不 育和 nap 胞质不育。波里马细胞质雄性不育因其不育性稳定，容易找到恢复基 因，此不育系被认为在杂交中的生产中是最有优势的。 甘蓝型油菜波利马 (Brassica napus pol)细胞质雄性不育系因其不育性稳定，容易找到恢复基 因，被认
13、为是一种很有实用价值的油菜胞质不育类型。目前关于其分子机制的 研究已证实，线粒体 ATP 合成酶的一个亚基 ATP 6 与其雄性不育相关。 以与 甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育有关的 atp 6 基因编码的 ATP 6 作为诱饵蛋 白，通过酵母双杂交技术，筛选与其相互作用的蛋白质，并克隆出其编码序列。本试验对其中的一个筛选结果进行研究。测序结果表明，由酵母双杂交所筛 选到的序列只是基因的 3端序列，并不是基因的完整序列。在此已知片段的 基础上，我们利用 cDNA 末端快速扩增(RACE)的方法对基因的 5#39;端 cDNA 进行扩增，测序后 blast 的比对结果表明，只是基因的部分序列，并
14、没有 扩增到基因全长序列。根据 RACE 的测序结果，设计引物，通过染色体步移的方 法进行基因的克隆。测序后，将酵母双杂交的测序结果，RACE 的测序结果，以 及染色体步移的测序结果进行序列拼接，根据拼接所得到的全长序列设计引物： 359-Up-primer： 5#39;-ATG ATG GAT ACT TTC CCT CCT TCG- 3#39;：359-Down-primer.5#39;-TCA CCA GAA GGG TAA CAA AAC ACA AG-3#39;，分别以油菜的总基因组 DNA 和反转的 cDNA 作为模板，进 行基因全长的扩增，连接到 pMD18-T 载体。测序结果分
15、析表明，此基因的 DNA 全长为 1172bp，cDNA 全长为 1011bp，内含子长 161bp，分为两段序列，其长度 分别为 79bp 和 82bp。在 NCBI 上进行比对分析，此基因含有水解酶家族十七的 保守结构域，该基因与拟南芥的编码未知蛋白的基因(GeneBank 登录号为 AA042272.1)同源性达 88，与拟南芥的推定的葡聚糖内切-1，3-beta-葡萄糖 酶 1 前体(GeneBank 登录号为 065539)的同源性为 88。利用网站和多种生物 学软件对推导出的氨基酸序列进行分析。分析结果表明，此氨基酸序列有以下 特征：(1)无信号肽序列：(2)有两个跨膜结构域。 由
16、于在油菜中还未见有此 基因序列的报道，其在油菜中的功能也是未知的。因此对该基因进行了载体的 构建。先用 Pst /BamH 酶切含有目标序列的 T 载体，连接到 pBlueseript SK 中间载体上面，再分别用 EcoR V/BamH 、EcoR V/Xba 酶切中间载体， 连接到真核表达载体上面。目前，已成功地把此基因构建到植物真核表达载体 pCAMBIA 2301G 中，准备通过农杆菌浸染途径，转入甘蓝型油菜对目标基因进 行过量表达和抑制表达。通过分析转基因油菜育性的变化，来揭示这个基因和 甘蓝型油菜雄性不育的关系。 细胞质雄性不育和核控制的育性恢复是广泛存在于植物中的生理现象。细胞质 雄性不育不仅是研究细胞核基因和细胞质基因相互作用的的重要材料，而且该 现象在杂种优势的利用中有着十分重要的作用。因此，研究哪些与细胞质雄性 不育有关的基因，利用基因工程的方法创造雄性不育系，在杂交中的生产中具 有重要的意义。 甘蓝型油菜是世界上广泛种植
