《烟粉虱对高效氯氰菊酯和阿维菌素抗性的生化和分子机理》由会员分享，可在线阅读，更多相关《烟粉虱对高效氯氰菊酯和阿维菌素抗性的生化和分子机理（34页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、农业昆虫与害虫防治专业优秀论文农业昆虫与害虫防治专业优秀论文 烟粉虱对高效氯氰菊酯和阿维烟粉虱对高效氯氰菊酯和阿维菌素抗性的生化和分子机理菌素抗性的生化和分子机理关键词：烟粉虱关键词：烟粉虱 氯氰菊酯氯氰菊酯 阿维菌素阿维菌素 代谢酶代谢酶 钠离子通道钠离子通道 谷氨酸受体谷氨酸受体摘要：一、烟粉虱生物型鉴定 利用西葫芦接虫法、酯酶同功酶电泳和线粒体 细胞色素氧化酶(mtDNACO)基因序列比较等方法对南京(NJ)品系烟粉虱生物 型进行了鉴定。NJ 品系烟粉虱接种西葫芦后能诱导西葫芦产生银叶症状，其酯 酶同功酶谱与 Q 型烟粉虱明显不同，mtDNA CO基因片段序列与 B 型烟粉虱同 源性达
2、98以上，这些结果说明 NJ 品系的生物型为 B 型。 二、烟粉虱钠通 道基因克隆与抗性相关突变 检测通过 RT-PCR 克隆了烟粉虱钠离子通道结构 域 S4-6cDNA 片段，发现位于 925 位亮氨酸到异亮氨酸的突变(L9251)与拟除 虫菊酯抗性相关，并建立了 L925突变的 PASA 检测技术。与 SUD-S 敏感品系 相比，NJ 品系对高效氯氰菊酯有 266 倍的抗性，采用高效氯氰菊酯对该种群进 行多次筛选后获得 NJ-R1 品系，对高效氯氰菊酯的抗性提高到 785 倍。PASA 检 测结果表明 NJ-R1 品系中 100个体都具有 L9251 突变(61.1的个体为 L925 突变
3、纯合子，38.9的个体为杂合子)，而未筛选的 NJ 品系只有 75个体具有 L925突变(35个体为 L925I 突变纯合子，40的个体为杂合子，25的野生 型)，该结果表明烟粉虱钠离子通道 L925突变与其对高效氯氰菊酯的抗性密 切相关。 三、Kdr 突变和代谢酶在 B 型烟粉虱对高效氯氰菊酯抗性中的相对 作用 NJ 品系对高效氯氰菊酯有 266 倍的抗性(与 SUD-S 品系相比)。通过对 NJ 品系进行群体筛选和单对交配筛选分别获得 NJ-R1 和 NJ-R2 品系，其对高效 氯氰菊酯的抗性分别达到 785 和 2634 倍。增效试验表明 PBO 对这三个品系的增 效作用均为 20 倍左
4、右，因为在烟粉虱中 PBO 即是多功能氧化酶抑制剂，也是酯 酶抑制剂，而谷胱甘肽 S-转移酶与抗性无关，因此推断代谢酶在 B 型烟粉虱对 高效氯氰菊酯的抗性发展中起到的相对作用可能为 20 倍左右，而且这种抗性是 B 型烟粉虱天生的：TPP(酯酶的专一性抑制剂)对 NJ 品系的增效作用为 12 倍， 说明 PBO 增效作用主要是由于抑制酯酶而引起的，即代谢抗性大部分由酯酶所 贡献。在解除代谢酶的作用后(通过 PBO 处理)， NJ-R2、NJ-R1 和 NJ 三个品系 对高效氯氰菊酯的抗性分别为 149，40 和 14 倍，这部分抗性由 kdr 突变所贡献。 这一结果说明 kdr 突变频率是
5、B 型烟粉虱对拟除虫菊酯抗性水平的决定因子， 因为 NJ-R2 品系为 L925突变纯合子，所以推测 kdr 突变的最大贡献可达约 150 倍。 四、烟粉虱对阿维菌素的抗性筛选和抗性生化机理 采用群体筛 选方法，用阿维菌素对采自南京地区的 B 型烟粉虱品系(NJ)连续筛选 18 代后获 得一个对阿维菌素具有 14.5 倍抗性的品系(NJ-Abm)。NJ-Abm 对锐劲特没有交 互抗性，对吡虫啉和阿维菌素类似物一甲氨基阿维菌素苯甲酸盐分别有 304 倍 和 4.4 倍的交互抗性。与 NJ 品系相比，NJ-Abm 品系的多功能氧化酶和谷胱甘 肽 S-转移酶活性分别提高了 2.1 和 2.0 倍。增
6、效剂 PBO 和 DEM 对 NJ-Abm 品系 分别有 3.9 和 4.1 倍的增效作用，对 NJ 品系的增效作用分别为 1.6 和 1.3 倍， TPP 对两个品系都没有增效作用。这些结果说明多功能氧化酶和谷胱甘肽 S-转 移酶活性上升是烟粉虱 NJ-Abm 品系对阿维菌素产生抗性的主要原因。 五、 烟粉虱谷氨酸受体基因 cDNA 的克隆和序列分析 采用 RT-PCR 和 RACE 技术， 首次获得 B 型烟粉虱谷氨酸受体 亚基 cDNA 全长序列，将该基因命名为BtGluCla1。BtGluCla1cDNA 序列长 1353bp，编码 450 个氧基酸。 Biast 基因 树显示 BtG
7、luCla1 与果蝇谷氨酸受体 亚基同源性最高(81，NP_732447)， 与昆虫谷氨酸受体 亚基亲缘关系较近，与线虫谷氨酸受体亚基亲缘关系较远。 Expasy 蛋白质功能区分析结果表明，BtGluCla1 亚基包括一个配基结合位点， 九个磷酸化位点和构成半胱氨酸环的四个半胱氨酸残基位点；TMHMM 跨膜区预 测结果表明 BtGluCla1 亚基有四个靠近 c 端的跨膜区。比较敏感(NJ)和抗性 (NJ-Abm)品系 BtGluCla1cDNA 序列，发现在 NJ-Abm 品系中存在 8 个氨基酸多态 性位点，NJ 品系中只有 3 个。另外，在 NJ 和 NJ-Abm 品系中均存在一个缺失跨
8、 膜区的谷氨酸受体基因，命名为 dBtGluCla1。在 NJ 品系 cDNA 中 dBtGluCla1 出现频率为 20，在 NJ-Abm 品系 cDNA 中 dBtGluCluCla1 出现的频率大于 80。单头烟粉虱成虫 BtGluCla1 基因组 DNA 序列分析表明，BtGluCla1 和 dBtGluCla1 由不同的基因编码，由此推测抗性和敏感品系 dBtGluCla1 出现频 率的差异可能是这两个基因相对表达量的不同而造成的。正文内容正文内容一、烟粉虱生物型鉴定 利用西葫芦接虫法、酯酶同功酶电泳和线粒体细 胞色素氧化酶(mtDNACO)基因序列比较等方法对南京(NJ)品系烟粉虱
9、生物型 进行了鉴定。NJ 品系烟粉虱接种西葫芦后能诱导西葫芦产生银叶症状，其酯酶 同功酶谱与 Q 型烟粉虱明显不同，mtDNA CO基因片段序列与 B 型烟粉虱同源 性达 98以上，这些结果说明 NJ 品系的生物型为 B 型。 二、烟粉虱钠通道 基因克隆与抗性相关突变 检测通过 RT-PCR 克隆了烟粉虱钠离子通道结构域 S4-6cDNA 片段，发现位于 925 位亮氨酸到异亮氨酸的突变(L9251)与拟除虫 菊酯抗性相关，并建立了 L925突变的 PASA 检测技术。与 SUD-S 敏感品系相 比，NJ 品系对高效氯氰菊酯有 266 倍的抗性，采用高效氯氰菊酯对该种群进行 多次筛选后获得 N
10、J-R1 品系，对高效氯氰菊酯的抗性提高到 785 倍。PASA 检测 结果表明 NJ-R1 品系中 100个体都具有 L9251 突变(61.1的个体为 L925突 变纯合子，38.9的个体为杂合子)，而未筛选的 NJ 品系只有 75个体具有 L925突变(35个体为 L925I 突变纯合子，40的个体为杂合子，25的野生 型)，该结果表明烟粉虱钠离子通道 L925突变与其对高效氯氰菊酯的抗性密 切相关。 三、Kdr 突变和代谢酶在 B 型烟粉虱对高效氯氰菊酯抗性中的相对 作用 NJ 品系对高效氯氰菊酯有 266 倍的抗性(与 SUD-S 品系相比)。通过对 NJ 品系进行群体筛选和单对交配
11、筛选分别获得 NJ-R1 和 NJ-R2 品系，其对高效 氯氰菊酯的抗性分别达到 785 和 2634 倍。增效试验表明 PBO 对这三个品系的增 效作用均为 20 倍左右，因为在烟粉虱中 PBO 即是多功能氧化酶抑制剂，也是酯 酶抑制剂，而谷胱甘肽 S-转移酶与抗性无关，因此推断代谢酶在 B 型烟粉虱对 高效氯氰菊酯的抗性发展中起到的相对作用可能为 20 倍左右，而且这种抗性是 B 型烟粉虱天生的：TPP(酯酶的专一性抑制剂)对 NJ 品系的增效作用为 12 倍， 说明 PBO 增效作用主要是由于抑制酯酶而引起的，即代谢抗性大部分由酯酶所 贡献。在解除代谢酶的作用后(通过 PBO 处理)，
12、NJ-R2、NJ-R1 和 NJ 三个品系 对高效氯氰菊酯的抗性分别为 149，40 和 14 倍，这部分抗性由 kdr 突变所贡献。 这一结果说明 kdr 突变频率是 B 型烟粉虱对拟除虫菊酯抗性水平的决定因子， 因为 NJ-R2 品系为 L925突变纯合子，所以推测 kdr 突变的最大贡献可达约 150 倍。 四、烟粉虱对阿维菌素的抗性筛选和抗性生化机理 采用群体筛 选方法，用阿维菌素对采自南京地区的 B 型烟粉虱品系(NJ)连续筛选 18 代后获 得一个对阿维菌素具有 14.5 倍抗性的品系(NJ-Abm)。NJ-Abm 对锐劲特没有交 互抗性，对吡虫啉和阿维菌素类似物一甲氨基阿维菌素苯
13、甲酸盐分别有 304 倍 和 4.4 倍的交互抗性。与 NJ 品系相比，NJ-Abm 品系的多功能氧化酶和谷胱甘 肽 S-转移酶活性分别提高了 2.1 和 2.0 倍。增效剂 PBO 和 DEM 对 NJ-Abm 品系 分别有 3.9 和 4.1 倍的增效作用，对 NJ 品系的增效作用分别为 1.6 和 1.3 倍， TPP 对两个品系都没有增效作用。这些结果说明多功能氧化酶和谷胱甘肽 S-转 移酶活性上升是烟粉虱 NJ-Abm 品系对阿维菌素产生抗性的主要原因。 五、 烟粉虱谷氨酸受体基因 cDNA 的克隆和序列分析 采用 RT-PCR 和 RACE 技术， 首次获得 B 型烟粉虱谷氨酸受体
14、 亚基 cDNA 全长序列，将该基因命名为 BtGluCla1。BtGluCla1cDNA 序列长 1353bp，编码 450 个氧基酸。 Biast 基因 树显示 BtGluCla1 与果蝇谷氨酸受体 亚基同源性最高(81，NP_732447)， 与昆虫谷氨酸受体 亚基亲缘关系较近，与线虫谷氨酸受体亚基亲缘关系较远。 Expasy 蛋白质功能区分析结果表明，BtGluCla1 亚基包括一个配基结合位点，九个磷酸化位点和构成半胱氨酸环的四个半胱氨酸残基位点；TMHMM 跨膜区预 测结果表明 BtGluCla1 亚基有四个靠近 c 端的跨膜区。比较敏感(NJ)和抗性 (NJ-Abm)品系 BtG
15、luCla1cDNA 序列，发现在 NJ-Abm 品系中存在 8 个氨基酸多态 性位点，NJ 品系中只有 3 个。另外，在 NJ 和 NJ-Abm 品系中均存在一个缺失跨 膜区的谷氨酸受体基因，命名为 dBtGluCla1。在 NJ 品系 cDNA 中 dBtGluCla1 出现频率为 20，在 NJ-Abm 品系 cDNA 中 dBtGluCluCla1 出现的频率大于 80。单头烟粉虱成虫 BtGluCla1 基因组 DNA 序列分析表明，BtGluCla1 和 dBtGluCla1 由不同的基因编码，由此推测抗性和敏感品系 dBtGluCla1 出现频 率的差异可能是这两个基因相对表达量
16、的不同而造成的。 一、烟粉虱生物型鉴定 利用西葫芦接虫法、酯酶同功酶电泳和线粒体细胞色 素氧化酶(mtDNACO)基因序列比较等方法对南京(NJ)品系烟粉虱生物型进行 了鉴定。NJ 品系烟粉虱接种西葫芦后能诱导西葫芦产生银叶症状，其酯酶同功 酶谱与 Q 型烟粉虱明显不同，mtDNA CO基因片段序列与 B 型烟粉虱同源性达 98以上，这些结果说明 NJ 品系的生物型为 B 型。 二、烟粉虱钠通道基因 克隆与抗性相关突变 检测通过 RT-PCR 克隆了烟粉虱钠离子通道结构域 S4-6cDNA 片段，发现位于 925 位亮氨酸到异亮氨酸的突变(L9251)与拟除虫菊 酯抗性相关，并建立了 L925突变的 PASA 检测技术。与 SUD-S 敏感品系相比， NJ 品系对高效氯氰菊酯有 266 倍的抗性，采用高效氯氰菊酯对该种群进行多次 筛选后获得 NJ-R1 品系，对高效
