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1、应用化学专业优秀论文应用化学专业优秀论文 烟曲霉壳聚糖酶基因的克隆与毕赤酵母表烟曲霉壳聚糖酶基因的克隆与毕赤酵母表达达关键词：壳聚糖酶基因关键词：壳聚糖酶基因 分泌表达分泌表达 毕赤酵母毕赤酵母 工程菌工程菌摘要：为了实现壳聚糖酶产业化的目的，本研究希望构建一种稳定、高效表达 的工程菌。 本研究在比较传统提取总 RNA 方法的基础上针对烟曲霉 (Aspergillusfumigatus)的一些特点获得一种改进的提取总 RNA 的新方法，并 利用这种方法从已知的产酶菌中提取了高质量的总 RNA。根据酶蛋白 N 端测序 的结果结合 Getaebank 中发布的壳聚糖酶基因序列设计出一对引物 Tlt
2、;,3gt;、Tlt;,4gt;，以提得的烟曲霉总 RNA 为模板 利用 RT-PCR 的手段成功调取壳聚糖酶的基因。为了使以后的纯化简单点，本项 研究采用了毕赤酵母分泌表达系统作为酶的表达生产工具。用限制性内切酶 Not 及 Avr 双酶切目的基因及空载体 pPIC9K，用连接酶将两者连接构建重 组载体。将构建的载体 pPIC9K-Csn 克隆进大肠杆菌 DH5 进行阳性克隆子的 挑选和测序。将测序正确的重组载体用 sal 线性化，经去磷酸化后电转化入 宿主菌 GS115，通过重组，带有目的基因的载体被整合到宿主菌的染色体。然 后用 MD 平板及酵落 PCR 的方法筛选阳性克隆子。将所得的阳
3、性克隆子用甲醇诱 导，然后对发酵液进行 SDS-PAGE 电泳检测及酶活性鉴定。经鉴定构建的表达系 统能够表达壳聚糖酶且有活性。 本次研究通过构建相关表达载体及工程菌株， 实现壳聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达，并对表达的产物进行了相关的生物活 性鉴定。为下一步的研究奠定基础。正文内容正文内容为了实现壳聚糖酶产业化的目的，本研究希望构建一种稳定、高效表达的 工程菌。 本研究在比较传统提取总 RNA 方法的基础上针对烟曲霉 (Aspergillusfumigatus)的一些特点获得一种改进的提取总 RNA 的新方法，并 利用这种方法从已知的产酶菌中提取了高质量的总 RNA。根据酶蛋白 N 端测序 的
4、结果结合 Getaebank 中发布的壳聚糖酶基因序列设计出一对引物 Tlt;,3gt;、Tlt;,4gt;，以提得的烟曲霉总 RNA 为模板 利用 RT-PCR 的手段成功调取壳聚糖酶的基因。为了使以后的纯化简单点，本项 研究采用了毕赤酵母分泌表达系统作为酶的表达生产工具。用限制性内切酶 Not 及 Avr 双酶切目的基因及空载体 pPIC9K，用连接酶将两者连接构建重 组载体。将构建的载体 pPIC9K-Csn 克隆进大肠杆菌 DH5 进行阳性克隆子的 挑选和测序。将测序正确的重组载体用 sal 线性化，经去磷酸化后电转化入 宿主菌 GS115，通过重组，带有目的基因的载体被整合到宿主菌的
5、染色体。然 后用 MD 平板及酵落 PCR 的方法筛选阳性克隆子。将所得的阳性克隆子用甲醇诱 导，然后对发酵液进行 SDS-PAGE 电泳检测及酶活性鉴定。经鉴定构建的表达系 统能够表达壳聚糖酶且有活性。 本次研究通过构建相关表达载体及工程菌株， 实现壳聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达，并对表达的产物进行了相关的生物活 性鉴定。为下一步的研究奠定基础。 为了实现壳聚糖酶产业化的目的，本研究希望构建一种稳定、高效表达的工程 菌。 本研究在比较传统提取总 RNA 方法的基础上针对烟曲霉 (Aspergillusfumigatus)的一些特点获得一种改进的提取总 RNA 的新方法，并 利用这种方法从已知
6、的产酶菌中提取了高质量的总 RNA。根据酶蛋白 N 端测序 的结果结合 Getaebank 中发布的壳聚糖酶基因序列设计出一对引物 Tlt;,3gt;、Tlt;,4gt;，以提得的烟曲霉总 RNA 为模板 利用 RT-PCR 的手段成功调取壳聚糖酶的基因。为了使以后的纯化简单点，本项 研究采用了毕赤酵母分泌表达系统作为酶的表达生产工具。用限制性内切酶 Not 及 Avr 双酶切目的基因及空载体 pPIC9K，用连接酶将两者连接构建重 组载体。将构建的载体 pPIC9K-Csn 克隆进大肠杆菌 DH5 进行阳性克隆子的 挑选和测序。将测序正确的重组载体用 sal 线性化，经去磷酸化后电转化入 宿
7、主菌 GS115，通过重组，带有目的基因的载体被整合到宿主菌的染色体。然 后用 MD 平板及酵落 PCR 的方法筛选阳性克隆子。将所得的阳性克隆子用甲醇诱 导，然后对发酵液进行 SDS-PAGE 电泳检测及酶活性鉴定。经鉴定构建的表达系 统能够表达壳聚糖酶且有活性。 本次研究通过构建相关表达载体及工程菌株， 实现壳聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达，并对表达的产物进行了相关的生物活 性鉴定。为下一步的研究奠定基础。 为了实现壳聚糖酶产业化的目的，本研究希望构建一种稳定、高效表达的工程 菌。 本研究在比较传统提取总 RNA 方法的基础上针对烟曲霉 (Aspergillusfumigatus)的一些特点
8、获得一种改进的提取总 RNA 的新方法，并 利用这种方法从已知的产酶菌中提取了高质量的总 RNA。根据酶蛋白 N 端测序 的结果结合 Getaebank 中发布的壳聚糖酶基因序列设计出一对引物 Tlt;,3gt;、Tlt;,4gt;，以提得的烟曲霉总 RNA 为模板 利用 RT-PCR 的手段成功调取壳聚糖酶的基因。为了使以后的纯化简单点，本项 研究采用了毕赤酵母分泌表达系统作为酶的表达生产工具。用限制性内切酶Not 及 Avr 双酶切目的基因及空载体 pPIC9K，用连接酶将两者连接构建重 组载体。将构建的载体 pPIC9K-Csn 克隆进大肠杆菌 DH5 进行阳性克隆子的 挑选和测序。将测
9、序正确的重组载体用 sal 线性化，经去磷酸化后电转化入 宿主菌 GS115，通过重组，带有目的基因的载体被整合到宿主菌的染色体。然 后用 MD 平板及酵落 PCR 的方法筛选阳性克隆子。将所得的阳性克隆子用甲醇诱 导，然后对发酵液进行 SDS-PAGE 电泳检测及酶活性鉴定。经鉴定构建的表达系 统能够表达壳聚糖酶且有活性。 本次研究通过构建相关表达载体及工程菌株， 实现壳聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达，并对表达的产物进行了相关的生物活 性鉴定。为下一步的研究奠定基础。 为了实现壳聚糖酶产业化的目的，本研究希望构建一种稳定、高效表达的工程 菌。 本研究在比较传统提取总 RNA 方法的基础上针对烟
10、曲霉 (Aspergillusfumigatus)的一些特点获得一种改进的提取总 RNA 的新方法，并 利用这种方法从已知的产酶菌中提取了高质量的总 RNA。根据酶蛋白 N 端测序 的结果结合 Getaebank 中发布的壳聚糖酶基因序列设计出一对引物 Tlt;,3gt;、Tlt;,4gt;，以提得的烟曲霉总 RNA 为模板 利用 RT-PCR 的手段成功调取壳聚糖酶的基因。为了使以后的纯化简单点，本项 研究采用了毕赤酵母分泌表达系统作为酶的表达生产工具。用限制性内切酶 Not 及 Avr 双酶切目的基因及空载体 pPIC9K，用连接酶将两者连接构建重 组载体。将构建的载体 pPIC9K-Cs
11、n 克隆进大肠杆菌 DH5 进行阳性克隆子的 挑选和测序。将测序正确的重组载体用 sal 线性化，经去磷酸化后电转化入 宿主菌 GS115，通过重组，带有目的基因的载体被整合到宿主菌的染色体。然 后用 MD 平板及酵落 PCR 的方法筛选阳性克隆子。将所得的阳性克隆子用甲醇诱 导，然后对发酵液进行 SDS-PAGE 电泳检测及酶活性鉴定。经鉴定构建的表达系 统能够表达壳聚糖酶且有活性。 本次研究通过构建相关表达载体及工程菌株， 实现壳聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达，并对表达的产物进行了相关的生物活 性鉴定。为下一步的研究奠定基础。 为了实现壳聚糖酶产业化的目的，本研究希望构建一种稳定、高效表达的
12、工程 菌。 本研究在比较传统提取总 RNA 方法的基础上针对烟曲霉 (Aspergillusfumigatus)的一些特点获得一种改进的提取总 RNA 的新方法，并 利用这种方法从已知的产酶菌中提取了高质量的总 RNA。根据酶蛋白 N 端测序 的结果结合 Getaebank 中发布的壳聚糖酶基因序列设计出一对引物 Tlt;,3gt;、Tlt;,4gt;，以提得的烟曲霉总 RNA 为模板 利用 RT-PCR 的手段成功调取壳聚糖酶的基因。为了使以后的纯化简单点，本项 研究采用了毕赤酵母分泌表达系统作为酶的表达生产工具。用限制性内切酶 Not 及 Avr 双酶切目的基因及空载体 pPIC9K，用连
13、接酶将两者连接构建重 组载体。将构建的载体 pPIC9K-Csn 克隆进大肠杆菌 DH5 进行阳性克隆子的 挑选和测序。将测序正确的重组载体用 sal 线性化，经去磷酸化后电转化入 宿主菌 GS115，通过重组，带有目的基因的载体被整合到宿主菌的染色体。然 后用 MD 平板及酵落 PCR 的方法筛选阳性克隆子。将所得的阳性克隆子用甲醇诱 导，然后对发酵液进行 SDS-PAGE 电泳检测及酶活性鉴定。经鉴定构建的表达系 统能够表达壳聚糖酶且有活性。 本次研究通过构建相关表达载体及工程菌株， 实现壳聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达，并对表达的产物进行了相关的生物活 性鉴定。为下一步的研究奠定基础。 为
14、了实现壳聚糖酶产业化的目的，本研究希望构建一种稳定、高效表达的工程菌。 本研究在比较传统提取总 RNA 方法的基础上针对烟曲霉 (Aspergillusfumigatus)的一些特点获得一种改进的提取总 RNA 的新方法，并 利用这种方法从已知的产酶菌中提取了高质量的总 RNA。根据酶蛋白 N 端测序 的结果结合 Getaebank 中发布的壳聚糖酶基因序列设计出一对引物 Tlt;,3gt;、Tlt;,4gt;，以提得的烟曲霉总 RNA 为模板 利用 RT-PCR 的手段成功调取壳聚糖酶的基因。为了使以后的纯化简单点，本项 研究采用了毕赤酵母分泌表达系统作为酶的表达生产工具。用限制性内切酶 N
15、ot 及 Avr 双酶切目的基因及空载体 pPIC9K，用连接酶将两者连接构建重 组载体。将构建的载体 pPIC9K-Csn 克隆进大肠杆菌 DH5 进行阳性克隆子的 挑选和测序。将测序正确的重组载体用 sal 线性化，经去磷酸化后电转化入 宿主菌 GS115，通过重组，带有目的基因的载体被整合到宿主菌的染色体。然 后用 MD 平板及酵落 PCR 的方法筛选阳性克隆子。将所得的阳性克隆子用甲醇诱 导，然后对发酵液进行 SDS-PAGE 电泳检测及酶活性鉴定。经鉴定构建的表达系 统能够表达壳聚糖酶且有活性。 本次研究通过构建相关表达载体及工程菌株， 实现壳聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达，并对表达的
16、产物进行了相关的生物活 性鉴定。为下一步的研究奠定基础。 为了实现壳聚糖酶产业化的目的，本研究希望构建一种稳定、高效表达的工程 菌。 本研究在比较传统提取总 RNA 方法的基础上针对烟曲霉 (Aspergillusfumigatus)的一些特点获得一种改进的提取总 RNA 的新方法，并 利用这种方法从已知的产酶菌中提取了高质量的总 RNA。根据酶蛋白 N 端测序 的结果结合 Getaebank 中发布的壳聚糖酶基因序列设计出一对引物 Tlt;,3gt;、Tlt;,4gt;，以提得的烟曲霉总 RNA 为模板 利用 RT-PCR 的手段成功调取壳聚糖酶的基因。为了使以后的纯化简单点，本项 研究采用了毕赤酵母分泌表达系统作为酶的表达生产工具。用限制性内切酶 Not 及 Avr 双酶切目的基因及空载体 pPIC9K，用连接酶将两者连接构建重 组载体。将构建的载体 pPIC9K-Csn 克隆进大肠杆菌 DH5 进行阳性克隆子的 挑选
