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1、微生物学专业优秀论文微生物学专业优秀论文 炭疽毒素受体的组织分布和活性位点的结炭疽毒素受体的组织分布和活性位点的结构与功能研究构与功能研究关键词：炭疽毒素关键词：炭疽毒素 炭疽毒素受体炭疽毒素受体 单克隆抗体单克隆抗体 免疫组织化学免疫组织化学 噬菌体噬菌体 随机肽库随机肽库摘要：目前已确认炭疽毒素在哺乳动物细胞上有两种天然受体 CMG2 与 TEM8， 但是这两种受体在体内的天然功能，以及在不同组织的分布还不十分清楚。已 有的研究表明，CMG2 与炭疽保护性抗原 PA 的亲合力比 TEM8 大的多，重组表达 CMG2 胞外区比重组表达 TEM8 胞外区的细胞保护活性高一百多倍，究竟 CMG2
2、 是 起主要作用的受体，还是 TEM8 是主要受体，或两者同样重要，也是未知。弄清 两者的组织分布和分子结构上的差异将为正确理解毒素致病机理与设计新型毒 素抑制剂提供依据。 为了解炭疽毒素受体的组织分布，本研究制备了两种受 体的单克隆抗体，获得了针对 CMG2 的单克隆抗体 485 和 4G3，针对 TEM8 的单 克隆抗体 2D6 和 489，以及可同时结合两者的单克隆抗体 2G4，其中 485 还具有 一定的细胞保护活性。经鉴定 485 和 2D6 可用于 ATR 体内外分布的检测，在对 小鼠的 9 个组织器官进行了 Western blotting 和免疫组化检测后发现，CMG2 和 T
3、EM8 广泛分布于各组织器官，在一些关键的组织中有明显的差别，不能确定 两种受体在机体内的分布谁强谁弱，但是在分布上的差异可能暗示了在不同的 炭疽感染途径中是不同的受体在起作用，肺炭疽时可能 CMG2 和 TEM8 均起作用， 皮肤炭疽和肠炭疽时则可能是 TEM8 为主。 出于探索炭疽毒素受体的结构与 功能，本研究还用大肠杆菌表达系统克隆表达了六个 CMG2 胞外区截短片段，经 蛋白纯化后，进行了 Western blotting 和细胞保护性实验分析。结果显示六个 截短的 CMG2 蛋白均可与 485 单抗结合，其中 CMG2(40-133)、CMG2(40-159)、 CMG2(40-18
4、6)和 CMG2(40-202)失去了细胞保护活性，CMG2(40-212)、CMG2(40- 207)保持了很强的细胞保护活性。经综合分析，可以初步确定，485 的结合位 点在 CMG2 上 40-133 氨基酸之间， CMG2 的 203-207 段 FQALK 氨基酸残基可能 是 PA 与 CMG2 相互作用的关键序列。 此外，以单抗 485 为靶分子对噬菌体随 机 12 肽库进行了筛选，希望得到一批特异性结合 485 的噬菌体肽，用来分析 CMG2 活性位点的组成和结构。结果显示，随机挑选的 8 个阳性克隆能够特异性 结合 485，并被 CMG2 所抑制，表现了它军事医学科学院硕士学位
5、论文们之间的 结构相关性。经序列对齐比较，8 个阳性克隆与 CMG2(40-217)可确定一个共有 序列：YI-LK，位于 CMG2 上的 119-125 处，与 MIDAS 基序中的关键氨基酸 T118 相临。此共有序列在 TEM8 中没有被发现，而这种不同也许就是它们在细 胞保护性方面差异比较大的原因，为我们设计新的治疗策略破坏 PA 与 ATR 相互 作用提供了依据。正文内容正文内容目前已确认炭疽毒素在哺乳动物细胞上有两种天然受体 CMG2 与 TEM8，但 是这两种受体在体内的天然功能，以及在不同组织的分布还不十分清楚。已有 的研究表明，CMG2 与炭疽保护性抗原 PA 的亲合力比 T
6、EM8 大的多，重组表达 CMG2 胞外区比重组表达 TEM8 胞外区的细胞保护活性高一百多倍，究竟 CMG2 是 起主要作用的受体，还是 TEM8 是主要受体，或两者同样重要，也是未知。弄清 两者的组织分布和分子结构上的差异将为正确理解毒素致病机理与设计新型毒 素抑制剂提供依据。 为了解炭疽毒素受体的组织分布，本研究制备了两种受 体的单克隆抗体，获得了针对 CMG2 的单克隆抗体 485 和 4G3，针对 TEM8 的单 克隆抗体 2D6 和 489，以及可同时结合两者的单克隆抗体 2G4，其中 485 还具有 一定的细胞保护活性。经鉴定 485 和 2D6 可用于 ATR 体内外分布的检测
7、，在对 小鼠的 9 个组织器官进行了 Western blotting 和免疫组化检测后发现，CMG2 和 TEM8 广泛分布于各组织器官，在一些关键的组织中有明显的差别，不能确定 两种受体在机体内的分布谁强谁弱，但是在分布上的差异可能暗示了在不同的 炭疽感染途径中是不同的受体在起作用，肺炭疽时可能 CMG2 和 TEM8 均起作用， 皮肤炭疽和肠炭疽时则可能是 TEM8 为主。 出于探索炭疽毒素受体的结构与 功能，本研究还用大肠杆菌表达系统克隆表达了六个 CMG2 胞外区截短片段，经 蛋白纯化后，进行了 Western blotting 和细胞保护性实验分析。结果显示六个 截短的 CMG2
8、蛋白均可与 485 单抗结合，其中 CMG2(40-133)、CMG2(40-159)、 CMG2(40-186)和 CMG2(40-202)失去了细胞保护活性，CMG2(40-212)、CMG2(40- 207)保持了很强的细胞保护活性。经综合分析，可以初步确定，485 的结合位 点在 CMG2 上 40-133 氨基酸之间， CMG2 的 203-207 段 FQALK 氨基酸残基可能 是 PA 与 CMG2 相互作用的关键序列。 此外，以单抗 485 为靶分子对噬菌体随 机 12 肽库进行了筛选，希望得到一批特异性结合 485 的噬菌体肽，用来分析 CMG2 活性位点的组成和结构。结果显
9、示，随机挑选的 8 个阳性克隆能够特异性 结合 485，并被 CMG2 所抑制，表现了它军事医学科学院硕士学位论文们之间的 结构相关性。经序列对齐比较，8 个阳性克隆与 CMG2(40-217)可确定一个共有 序列：YI-LK，位于 CMG2 上的 119-125 处，与 MIDAS 基序中的关键氨基酸 T118 相临。此共有序列在 TEM8 中没有被发现，而这种不同也许就是它们在细 胞保护性方面差异比较大的原因，为我们设计新的治疗策略破坏 PA 与 ATR 相互 作用提供了依据。 目前已确认炭疽毒素在哺乳动物细胞上有两种天然受体 CMG2 与 TEM8，但是这 两种受体在体内的天然功能，以及
10、在不同组织的分布还不十分清楚。已有的研 究表明，CMG2 与炭疽保护性抗原 PA 的亲合力比 TEM8 大的多，重组表达 CMG2 胞外区比重组表达 TEM8 胞外区的细胞保护活性高一百多倍，究竟 CMG2 是起主 要作用的受体，还是 TEM8 是主要受体，或两者同样重要，也是未知。弄清两者 的组织分布和分子结构上的差异将为正确理解毒素致病机理与设计新型毒素抑 制剂提供依据。 为了解炭疽毒素受体的组织分布，本研究制备了两种受体的 单克隆抗体，获得了针对 CMG2 的单克隆抗体 485 和 4G3，针对 TEM8 的单克隆 抗体 2D6 和 489，以及可同时结合两者的单克隆抗体 2G4，其中
11、485 还具有一定 的细胞保护活性。经鉴定 485 和 2D6 可用于 ATR 体内外分布的检测，在对小鼠 的 9 个组织器官进行了 Western blotting 和免疫组化检测后发现，CMG2 和 TEM8 广泛分布于各组织器官，在一些关键的组织中有明显的差别，不能确定两种受体在机体内的分布谁强谁弱，但是在分布上的差异可能暗示了在不同的炭 疽感染途径中是不同的受体在起作用，肺炭疽时可能 CMG2 和 TEM8 均起作用， 皮肤炭疽和肠炭疽时则可能是 TEM8 为主。 出于探索炭疽毒素受体的结构与 功能，本研究还用大肠杆菌表达系统克隆表达了六个 CMG2 胞外区截短片段，经 蛋白纯化后，进
12、行了 Western blotting 和细胞保护性实验分析。结果显示六个 截短的 CMG2 蛋白均可与 485 单抗结合，其中 CMG2(40-133)、CMG2(40-159)、 CMG2(40-186)和 CMG2(40-202)失去了细胞保护活性，CMG2(40-212)、CMG2(40- 207)保持了很强的细胞保护活性。经综合分析，可以初步确定，485 的结合位 点在 CMG2 上 40-133 氨基酸之间， CMG2 的 203-207 段 FQALK 氨基酸残基可能 是 PA 与 CMG2 相互作用的关键序列。 此外，以单抗 485 为靶分子对噬菌体随 机 12 肽库进行了筛选
13、，希望得到一批特异性结合 485 的噬菌体肽，用来分析 CMG2 活性位点的组成和结构。结果显示，随机挑选的 8 个阳性克隆能够特异性 结合 485，并被 CMG2 所抑制，表现了它军事医学科学院硕士学位论文们之间的 结构相关性。经序列对齐比较，8 个阳性克隆与 CMG2(40-217)可确定一个共有 序列：YI-LK，位于 CMG2 上的 119-125 处，与 MIDAS 基序中的关键氨基酸 T118 相临。此共有序列在 TEM8 中没有被发现，而这种不同也许就是它们在细 胞保护性方面差异比较大的原因，为我们设计新的治疗策略破坏 PA 与 ATR 相互 作用提供了依据。 目前已确认炭疽毒素
14、在哺乳动物细胞上有两种天然受体 CMG2 与 TEM8，但是这 两种受体在体内的天然功能，以及在不同组织的分布还不十分清楚。已有的研 究表明，CMG2 与炭疽保护性抗原 PA 的亲合力比 TEM8 大的多，重组表达 CMG2 胞外区比重组表达 TEM8 胞外区的细胞保护活性高一百多倍，究竟 CMG2 是起主 要作用的受体，还是 TEM8 是主要受体，或两者同样重要，也是未知。弄清两者 的组织分布和分子结构上的差异将为正确理解毒素致病机理与设计新型毒素抑 制剂提供依据。 为了解炭疽毒素受体的组织分布，本研究制备了两种受体的 单克隆抗体，获得了针对 CMG2 的单克隆抗体 485 和 4G3，针对
15、 TEM8 的单克隆 抗体 2D6 和 489，以及可同时结合两者的单克隆抗体 2G4，其中 485 还具有一定 的细胞保护活性。经鉴定 485 和 2D6 可用于 ATR 体内外分布的检测，在对小鼠 的 9 个组织器官进行了 Western blotting 和免疫组化检测后发现，CMG2 和 TEM8 广泛分布于各组织器官，在一些关键的组织中有明显的差别，不能确定两 种受体在机体内的分布谁强谁弱，但是在分布上的差异可能暗示了在不同的炭 疽感染途径中是不同的受体在起作用，肺炭疽时可能 CMG2 和 TEM8 均起作用， 皮肤炭疽和肠炭疽时则可能是 TEM8 为主。 出于探索炭疽毒素受体的结构
16、与 功能，本研究还用大肠杆菌表达系统克隆表达了六个 CMG2 胞外区截短片段，经 蛋白纯化后，进行了 Western blotting 和细胞保护性实验分析。结果显示六个 截短的 CMG2 蛋白均可与 485 单抗结合，其中 CMG2(40-133)、CMG2(40-159)、 CMG2(40-186)和 CMG2(40-202)失去了细胞保护活性，CMG2(40-212)、CMG2(40- 207)保持了很强的细胞保护活性。经综合分析，可以初步确定，485 的结合位 点在 CMG2 上 40-133 氨基酸之间， CMG2 的 203-207 段 FQALK 氨基酸残基可能 是 PA 与 CMG2 相互作用的关键序列。 此外，以单抗 485 为靶分子对噬菌体随 机 12 肽库进行了筛选，希望得到一批特异性结合 485 的噬菌体肽，用来分析 CMG2 活性位点的组成和结构。结果显示，随机挑选的 8 个阳性克隆能够特异性 结合 485，并被 CMG2 所抑制，表现了它军事医学科学院硕士学位论文们之间的 结构相关性
