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1、消化内科专业毕业论文消化内科专业毕业论文 精品论文精品论文 分子伴侣分子伴侣 Grp78Grp78 对肝细胞癌对肝细胞癌侵袭和转移的影响侵袭和转移的影响关键词：葡萄糖调节蛋白关键词：葡萄糖调节蛋白 7878 肝细胞癌肝细胞癌 黏着斑激酶黏着斑激酶 上皮上皮- -间叶转化间叶转化 细胞极性细胞极性 基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶 2 2摘要：研究背景与目的： 肝细胞癌(HCC)是世界上第五大常见肿瘤，每年 死于 HCC 患者人数超过 500，000 例。近年来 HCC 的治疗理念、策略、模式、技 术乃至医疗组织结构都经历了重大演变。尽管多专科和多元化治疗模式显著改 变了 HCC 的治疗效果，但 H
2、CC 治疗仍然面临着严峻的挑战。早期发生的门静脉 侵袭和肝内转移，是肝癌病人手术后复发率高，预后差的最重要原因之一目 前肝细胞癌的侵袭和转移机制还不很清楚，因此探索肿瘤侵袭和转移的机制、 寻找抑制肿瘤侵袭和转移的有效靶点，一直是国内外研究的热点。 葡萄糖调 节蛋白 78(Grp78)是内质网合成分泌的一种多功能蛋白质，对于折叠，成熟、 转运蛋白质到细胞外发挥重要的作用。许多研究表明在肿瘤的发生和发展过程 中伴随着 Grp78 表达和功能的改变。最近的研究揭示了 Grp78 在转移肿瘤表面 表达，并且增高的 Grp78 表达与淋巴结转移程度密切相关，这表明 Grp78 在肿 瘤的侵袭和转移中可能
3、发挥重要的调节作用。 本研究旨在应用免疫组织化学 方法在人肝细胞癌组织中检测 Grp78，FAK 的表达，并应用小干扰 RNA(siRNA) 技术特异性下调 Grp78 在肝癌细胞株 BEL7402 中的表达，探讨 Grp78 在肝细胞 癌侵袭和转移中的作用及分子机制。 实验方法： 一、肝癌组织中 Gap78 和 FAK 表达的相关性研究应用免疫组织化学方法检测 44 例人肝细胞癌手 术切除组织中 Grp78，FAK 的表达及 tyr397 的磷酸化情况。每个组织标本取 3 张切片，每张切片随机选取 10 个高倍视野进行观察、评分，统计学分析。 二、特异性下调 Grp78 对肝细胞癌侵袭和转移
4、的影响通过 siRNA 技术特异性下 调人肝细胞癌细胞株 BEL7402 中 Grp78 的表达，应用 Transwell 法和划痕法对 肝细胞癌侵袭，转移能力的改变进行分析；应用免疫沉淀技术和 GST-pulldown 技术分别对 FAK 的磷酸化水平和小 GTPase RhoA 的活性进行研究；应用免疫印 迹技术检测 E-钙黏素，N-钙黏素和波形蛋白(Vimentin)的表达。 三、特异 性下调 Grp78 抑制肝细胞癌侵袭和转移的分子机制通过 siRNA 技术特异性下调 人肝细胞癌细胞株 BEL7402 中 Grp78 的表达，应用细胞黏附实验和细胞伸展实 验观察特异性下调 Grp78
5、对细胞黏附特性和细胞极性形成的影响；应用明胶酶 谱实验检测基质金属蛋白酶(MMPs)的活性；用免疫印迹实验检测细胞外基质重 构相关蛋白基质金属蛋白酶-2，9(MMP-2，9)的表达以及转录因子 c-jun 的表达 及磷酸化状态 实验结果： 一、肝癌组织中 Grp78 和 FAK 表达的相关 性研究应用免疫组织化学方法检测 44 例人肝细胞癌组织中 Grp78、FAK 的表达 情况，结果显示 Grp78、FAK 表达与肝癌细胞的分化程度呈负相关 (r=0.456，P=0.001；r=0.312，P=0.039)。研究结果还显示在 44 例肝细胞癌中 Grp78 和 FAK 呈正相关(r=0.43
6、4，p=0.001)。 anti-FAK-p-tyr397 抗体免疫 组织化学方法检测人肝细胞癌中 FAK 的活性，结果表明 FAK-p-tyr397 染色强度 与肿瘤细胞的分化程度不相关，Grp78 的表达和磷酸化 FAK 不相关。 二、特 异性下调 Grp78 对肝细胞癌侵袭和转移的影响 Transwell 实验显示 Grp78- siRNA 转染细胞每个低倍视野细胞数平均为 83 个，明显低于未转染细胞(平均210 个胝倍视野)和非特异性 siRNA 转染细胞(平均 220 个/低倍视野)，统计学 分析表明具有显著性差异(P0.05)这表明特异性下调 Grp78 可以抑制肝细胞 癌的侵袭
7、。 划痕法实验结果显示，24h 后 Grp78-siRNA 转染细胞的创口愈合 较慢(53)，而未转染细胞(92)和非特异性 siRNA 转染细胞(94)创口基本 愈合。统计学分析表明具有显著差异(p0.05) 免疫沉淀实验结果表明， 在 Crp78-siRNA 转染细胞中 FAK 的磷酸化水平明显低于未转染细胞和非特异性 转染细胞，统计学分析具有显著差异(p0.05)；免疫印迹实验结果表明在 Grp78-siRNA 转染细胞、未转染细胞和非特异性转染细胞中，FAK 的表达没有差 异(p0.05)以上结果表明特异性下调 Grp78 表达可以抑制 FAK 的磷酸化。 GST pull-down
8、实验结果显示在 Grp78-siRNA 转染细胞中，RhoA-GTP(活性形式)的 水平明显高于未转染细胞和非特异性转染细胞，统计学分析差异有统计学意义 (p0.05)，这表明特异性下调 Grp78 可以促进 RhoA 的活化；免疫印迹实验结 果表明，在 Grp78-siRNA 转染细胞、未转染细胞和非特异性转染细胞中，RhoA 的表达水平没有显著差异。 免疫印迹实验结果表明，在 Grp78-siRNA 转染细 胞中 N-钙黏素、波形蛋白的表达明显低于未转染细胞和非特异性转染细胞，而 E-钙黏素的表达明显高于未转染细胞和非特异性转染细胞，经统计学分析有显 著性差异(p0.05)。 三、特异性下
9、调 Grp78 抑制肝细胞癌侵袭和转移的分 子机制应用细胞伸展实验对 Grp78-siRNA 转染细胞的极性形成进行研究，结果 表明在不同时间点 Grp78-siRNA 转染细胞的伸展明显落后于非特异性 RNA 转染 细胞和未转染细胞(p0.05) 应用明胶酶谱技术和免疫印迹技术对 Grp78- siRNA 转染细胞中 MMP-2、MMP-9 的表达与活性进行检测，明胶酶谱的实验结果 显示 Grp78-siRNA 转染细胞 MMP-2、MMP-9 的活性明显低于非特异性转染细胞和 未转染细胞；免疫印迹实验结果表明 Grp78-siRNA 转染细胞中 MMP-2、MMP-9 的 表达明显低于非特
10、异性转染细胞和未转染细胞。 应用免疫印迹技术检测转录 因子 c-jun 的表达及磷酸化水平，结果发现在 Grp78-siRNA 转染细胞中，c-jun 的磷酸化水平明显降低，而 c-jun 的表达没有变化。 实验结论： 1.在 人肝细胞癌组织中 Grp78 和 FAK 的表达与肝细胞癌的分化程度呈负相关；FAK- p-tyr397 的表达与肝细胞癌的分化程度不相关； 2.Grp78 在肝细胞癌组织中 的表达与 FAK 的表达呈正相关； 3.特异性下调 Grp78 可以抑制肝细胞癌的侵 袭和转移，这种作用是通过抑制上皮-间叶转化和参与 FAK 信号转导通路的调节 实现的。 4.特异性下调 Grp
11、78 可以抑制肝癌细胞的黏着斑转换、细胞极性形 成和细胞外基质的降解。 5.Grp78 可作为肝细胞癌治疗的一个重要靶点。正文内容正文内容研究背景与目的： 肝细胞癌(HCC)是世界上第五大常见肿瘤，每年死 于 HCC 患者人数超过 500，000 例。近年来 HCC 的治疗理念、策略、模式、技术 乃至医疗组织结构都经历了重大演变。尽管多专科和多元化治疗模式显著改变 了 HCC 的治疗效果，但 HCC 治疗仍然面临着严峻的挑战。早期发生的门静脉侵 袭和肝内转移，是肝癌病人手术后复发率高，预后差的最重要原因之一目前 肝细胞癌的侵袭和转移机制还不很清楚，因此探索肿瘤侵袭和转移的机制、寻 找抑制肿瘤侵
12、袭和转移的有效靶点，一直是国内外研究的热点。 葡萄糖调节 蛋白 78(Grp78)是内质网合成分泌的一种多功能蛋白质，对于折叠，成熟、转 运蛋白质到细胞外发挥重要的作用。许多研究表明在肿瘤的发生和发展过程中 伴随着 Grp78 表达和功能的改变。最近的研究揭示了 Grp78 在转移肿瘤表面表 达，并且增高的 Grp78 表达与淋巴结转移程度密切相关，这表明 Grp78 在肿瘤 的侵袭和转移中可能发挥重要的调节作用。 本研究旨在应用免疫组织化学方 法在人肝细胞癌组织中检测 Grp78，FAK 的表达，并应用小干扰 RNA(siRNA)技 术特异性下调 Grp78 在肝癌细胞株 BEL7402 中
13、的表达，探讨 Grp78 在肝细胞癌 侵袭和转移中的作用及分子机制。 实验方法： 一、肝癌组织中 Gap78 和 FAK 表达的相关性研究应用免疫组织化学方法检测 44 例人肝细胞癌手术切除 组织中 Grp78，FAK 的表达及 tyr397 的磷酸化情况。每个组织标本取 3 张切片， 每张切片随机选取 10 个高倍视野进行观察、评分，统计学分析。 二、特异 性下调 Grp78 对肝细胞癌侵袭和转移的影响通过 siRNA 技术特异性下调人肝细 胞癌细胞株 BEL7402 中 Grp78 的表达，应用 Transwell 法和划痕法对肝细胞癌 侵袭，转移能力的改变进行分析；应用免疫沉淀技术和 G
14、ST-pulldown 技术分别 对 FAK 的磷酸化水平和小 GTPase RhoA 的活性进行研究；应用免疫印迹技术检 测 E-钙黏素，N-钙黏素和波形蛋白(Vimentin)的表达。 三、特异性下调 Grp78 抑制肝细胞癌侵袭和转移的分子机制通过 siRNA 技术特异性下调人肝细 胞癌细胞株 BEL7402 中 Grp78 的表达，应用细胞黏附实验和细胞伸展实验观察 特异性下调 Grp78 对细胞黏附特性和细胞极性形成的影响；应用明胶酶谱实验 检测基质金属蛋白酶(MMPs)的活性；用免疫印迹实验检测细胞外基质重构相关 蛋白基质金属蛋白酶-2，9(MMP-2，9)的表达以及转录因子 c-
15、jun 的表达及磷酸 化状态 实验结果： 一、肝癌组织中 Grp78 和 FAK 表达的相关性研究 应用免疫组织化学方法检测 44 例人肝细胞癌组织中 Grp78、FAK 的表达情况， 结果显示 Grp78、FAK 表达与肝癌细胞的分化程度呈负相关 (r=0.456，P=0.001；r=0.312，P=0.039)。研究结果还显示在 44 例肝细胞癌中 Grp78 和 FAK 呈正相关(r=0.434，p=0.001)。 anti-FAK-p-tyr397 抗体免疫 组织化学方法检测人肝细胞癌中 FAK 的活性，结果表明 FAK-p-tyr397 染色强度 与肿瘤细胞的分化程度不相关，Grp7
16、8 的表达和磷酸化 FAK 不相关。 二、特 异性下调 Grp78 对肝细胞癌侵袭和转移的影响 Transwell 实验显示 Grp78- siRNA 转染细胞每个低倍视野细胞数平均为 83 个，明显低于未转染细胞(平均 210 个胝倍视野)和非特异性 siRNA 转染细胞(平均 220 个/低倍视野)，统计学 分析表明具有显著性差异(P0.05)这表明特异性下调 Grp78 可以抑制肝细胞 癌的侵袭。 划痕法实验结果显示，24h 后 Grp78-siRNA 转染细胞的创口愈合 较慢(53)，而未转染细胞(92)和非特异性 siRNA 转染细胞(94)创口基本 愈合。统计学分析表明具有显著差异(p0.05) 免疫沉淀实验结果表明，在 Crp78-siRNA 转染细胞中 FAK 的磷酸化水平明显低于未转染细胞和非特异性 转
