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1、作物生物技术专业毕业论文作物生物技术专业毕业论文 精品论文精品论文 木聚糖酶的酶学特性及木聚糖酶的酶学特性及基因克隆表达研究基因克隆表达研究关键词：黑曲霉关键词：黑曲霉 木聚糖酶木聚糖酶 发酵工艺发酵工艺 毕赤酵母毕赤酵母 基因克隆基因克隆 酶学特性酶学特性摘要：木聚糖(xylan)是一种多聚五碳糖，是植物半纤维素的重要组分，它占植 物碳水化合物总量的三分之一，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的可 再生生物资源。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一类酶的总称。 它可以将木聚糖降解为寡聚木糖、木糖和少量单糖。它在饲料、造纸、食品、 制药以及能源工业中均有着广泛的应用。本论文主要对黑曲
2、霉产木聚糖酶进行 了如下研究： 1.黑曲霉培养基的优化。通过单因素试验及正交试验确定了黑 曲霉液体发酵产木聚糖酶最适的发酵培养条件为：麸皮 80g/L，酵母膏 15g/L，Tween802g/L，无机盐 K2HPO4 为 2.6，CaCl2 为 0.5，MgSO4.7H2O 为 1，FeSO4.7H2O 为 0.016，装液量为 50 ml/250 ml，培养的起始 pH 为 5.0，培养温度为 28，培养时间为 72 h，摇床的转速为 150r/min，在此条件 下，菌株产木聚糖酶活性较高，能提高至酶活为 85.3U/ml。 2.用双水相法 提纯木聚糖酶。本文利用双水相法对木聚糖酶粗酶进行提
3、纯，确定最佳的纯化 条件为：PEG4000 浓度为 19(w/w)、磷酸氢二钾浓度为 10(w/w)、氯化钠浓 度为 0(w/w)。在此条件下，木聚糖酶的提取效果较好，K 和 Yt 的值分别为 29.34 和 88.67。 3.木聚糖酶酶学性质的研究。本论文对黑曲霉产木聚糖 酶的酶学性质进行了研究，结果表明：该木聚糖酶的最适反应温度为 50，最 适 pH 为 5.0，在酸性的条件 pH3.06.0 的范围内稳定性较好，是典型的酸性 木聚糖酶；在 4050间的热稳定性较好。在金属离子中，Fe2+、Mg2+、Zn2+ 对木聚糖酶的酶活有不同程度的促进作用：Al3+对木聚糖酶稍有影响使其活力 降低；
4、而其余的大部分金属离子对酶的活性的影响并不大，并没有发现对酶有 着明显激活或抑制作用的离子。 4.本论文以黑曲霉菌株基因组 DNA 和 cDNA 为模板，通过 PCR 扩增出得到一条大小约为 750bp 和 680bp 的片段，测序结果 表明该 DNA 基因全长 746bp，含有 68bp 的内含子，基因编码区长 678bp，目前， 该基因已提交 Gen Bank，登录号为 EU423881。 。 将测序所得正确的 xynB 结 构基因与酵母分泌型表达载体 pPIC9K 进行连接，转化大肠杆菌 DH-5，构建 表达载体 pPIC9K-xynB。后用电击转化法将重组质粒转化毕赤酵母(Pichia
5、 pastorisGS115)，经 MM/MD 快慢斑进行筛选，并挑取数个慢斑进行甲醇诱导培 养，46 天后，将其点于 RBB-木聚糖平板上，可见产生了明显的透明圈。工程 菌 SMD-xynB-2 木聚糖酶产量达到 216U/ml，比原出发菌株提高了 2.53 倍，表 达产物具有生物学活性，分泌到细胞外，可溶且木聚糖酶的表达具有良好的遗 传稳定性。重组木聚糖酶的酶学性质与原始木聚糖酶基本相同，分别为最佳反 应温度为 50，最适 pH 约为 5.0，热稳定性和原菌株相比，在 4070时 变化不明显，80比原菌株下降 0.2。探索了不同碳源、不同氮源及甲醇的 添加量对重组酵母产木聚糖酶的影响，结果
6、表明：最佳的碳源为麸皮，最佳的 氮源为牛肉膏，甲醇的添加量为 0.5诱导效果最好。SDS-PAGE 电泳表明，重 组酵母产木聚糖酶的分子量约为 24KD。 5.以紫花苜蓿无菌苗的下胚轴、子 叶、叶片和叶柄为外植体，研究了不同培养基、不同激素种类和配比对胚性愈 伤组织诱导的影响，以及不同分化培养基对胚状体分化的影响。结果表明：下胚轴外植体胚性愈伤组织诱导率最高；最佳胚性愈伤组织诱导培养基为改良 SH+2.0mg/L2.4-D+0.5 mg/L6-BA；最佳胚状体诱导培养基为 MSO+2.0 mg/L6- BA+0.5mg/L NAA：成苗培养基为 1/2MS+1蔗糖+0.7琼脂。构建了 PBI1
7、21- xynB 表达载体，经酶切鉴定，构建成功，并转化苜蓿，但转化率低，提取叶片 测得酶活为 10.5U/g。正文内容正文内容木聚糖(xylan)是一种多聚五碳糖，是植物半纤维素的重要组分，它占植物 碳水化合物总量的三分之一，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的可再 生生物资源。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一类酶的总称。 它可以将木聚糖降解为寡聚木糖、木糖和少量单糖。它在饲料、造纸、食品、 制药以及能源工业中均有着广泛的应用。本论文主要对黑曲霉产木聚糖酶进行 了如下研究： 1.黑曲霉培养基的优化。通过单因素试验及正交试验确定了黑 曲霉液体发酵产木聚糖酶最适的发酵培养条件为：麸
8、皮 80g/L，酵母膏 15g/L，Tween802g/L，无机盐 K2HPO4 为 2.6，CaCl2 为 0.5，MgSO4.7H2O 为 1，FeSO4.7H2O 为 0.016，装液量为 50 ml/250 ml，培养的起始 pH 为 5.0，培养温度为 28，培养时间为 72 h，摇床的转速为 150r/min，在此条件 下，菌株产木聚糖酶活性较高，能提高至酶活为 85.3U/ml。 2.用双水相法 提纯木聚糖酶。本文利用双水相法对木聚糖酶粗酶进行提纯，确定最佳的纯化 条件为：PEG4000 浓度为 19(w/w)、磷酸氢二钾浓度为 10(w/w)、氯化钠浓 度为 0(w/w)。在此
9、条件下，木聚糖酶的提取效果较好，K 和 Yt 的值分别为 29.34 和 88.67。 3.木聚糖酶酶学性质的研究。本论文对黑曲霉产木聚糖 酶的酶学性质进行了研究，结果表明：该木聚糖酶的最适反应温度为 50，最 适 pH 为 5.0，在酸性的条件 pH3.06.0 的范围内稳定性较好，是典型的酸性 木聚糖酶；在 4050间的热稳定性较好。在金属离子中，Fe2+、Mg2+、Zn2+ 对木聚糖酶的酶活有不同程度的促进作用：Al3+对木聚糖酶稍有影响使其活力 降低；而其余的大部分金属离子对酶的活性的影响并不大，并没有发现对酶有 着明显激活或抑制作用的离子。 4.本论文以黑曲霉菌株基因组 DNA 和
10、cDNA 为模板，通过 PCR 扩增出得到一条大小约为 750bp 和 680bp 的片段，测序结果 表明该 DNA 基因全长 746bp，含有 68bp 的内含子，基因编码区长 678bp，目前， 该基因已提交 Gen Bank，登录号为 EU423881。 。 将测序所得正确的 xynB 结 构基因与酵母分泌型表达载体 pPIC9K 进行连接，转化大肠杆菌 DH-5，构建 表达载体 pPIC9K-xynB。后用电击转化法将重组质粒转化毕赤酵母(Pichia pastorisGS115)，经 MM/MD 快慢斑进行筛选，并挑取数个慢斑进行甲醇诱导培 养，46 天后，将其点于 RBB-木聚糖平
11、板上，可见产生了明显的透明圈。工程 菌 SMD-xynB-2 木聚糖酶产量达到 216U/ml，比原出发菌株提高了 2.53 倍，表 达产物具有生物学活性，分泌到细胞外，可溶且木聚糖酶的表达具有良好的遗 传稳定性。重组木聚糖酶的酶学性质与原始木聚糖酶基本相同，分别为最佳反 应温度为 50，最适 pH 约为 5.0，热稳定性和原菌株相比，在 4070时 变化不明显，80比原菌株下降 0.2。探索了不同碳源、不同氮源及甲醇的 添加量对重组酵母产木聚糖酶的影响，结果表明：最佳的碳源为麸皮，最佳的 氮源为牛肉膏，甲醇的添加量为 0.5诱导效果最好。SDS-PAGE 电泳表明，重 组酵母产木聚糖酶的分子
12、量约为 24KD。 5.以紫花苜蓿无菌苗的下胚轴、子 叶、叶片和叶柄为外植体，研究了不同培养基、不同激素种类和配比对胚性愈 伤组织诱导的影响，以及不同分化培养基对胚状体分化的影响。结果表明：下 胚轴外植体胚性愈伤组织诱导率最高；最佳胚性愈伤组织诱导培养基为改良 SH+2.0mg/L2.4-D+0.5 mg/L6-BA；最佳胚状体诱导培养基为 MSO+2.0 mg/L6- BA+0.5mg/L NAA：成苗培养基为 1/2MS+1蔗糖+0.7琼脂。构建了 PBI121- xynB 表达载体，经酶切鉴定，构建成功，并转化苜蓿，但转化率低，提取叶片测得酶活为 10.5U/g。 木聚糖(xylan)是
13、一种多聚五碳糖，是植物半纤维素的重要组分，它占植物碳水 化合物总量的三分之一，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的可再生生 物资源。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一类酶的总称。它可 以将木聚糖降解为寡聚木糖、木糖和少量单糖。它在饲料、造纸、食品、制药 以及能源工业中均有着广泛的应用。本论文主要对黑曲霉产木聚糖酶进行了如 下研究： 1.黑曲霉培养基的优化。通过单因素试验及正交试验确定了黑曲霉 液体发酵产木聚糖酶最适的发酵培养条件为：麸皮 80g/L，酵母膏 15g/L，Tween802g/L，无机盐 K2HPO4 为 2.6，CaCl2 为 0.5，MgSO4.7H2O 为 1，F
14、eSO4.7H2O 为 0.016，装液量为 50 ml/250 ml，培养的起始 pH 为 5.0，培养温度为 28，培养时间为 72 h，摇床的转速为 150r/min，在此条件 下，菌株产木聚糖酶活性较高，能提高至酶活为 85.3U/ml。 2.用双水相法 提纯木聚糖酶。本文利用双水相法对木聚糖酶粗酶进行提纯，确定最佳的纯化 条件为：PEG4000 浓度为 19(w/w)、磷酸氢二钾浓度为 10(w/w)、氯化钠浓 度为 0(w/w)。在此条件下，木聚糖酶的提取效果较好，K 和 Yt 的值分别为 29.34 和 88.67。 3.木聚糖酶酶学性质的研究。本论文对黑曲霉产木聚糖 酶的酶学性
15、质进行了研究，结果表明：该木聚糖酶的最适反应温度为 50，最 适 pH 为 5.0，在酸性的条件 pH3.06.0 的范围内稳定性较好，是典型的酸性 木聚糖酶；在 4050间的热稳定性较好。在金属离子中，Fe2+、Mg2+、Zn2+ 对木聚糖酶的酶活有不同程度的促进作用：Al3+对木聚糖酶稍有影响使其活力 降低；而其余的大部分金属离子对酶的活性的影响并不大，并没有发现对酶有 着明显激活或抑制作用的离子。 4.本论文以黑曲霉菌株基因组 DNA 和 cDNA 为模板，通过 PCR 扩增出得到一条大小约为 750bp 和 680bp 的片段，测序结果 表明该 DNA 基因全长 746bp，含有 68
16、bp 的内含子，基因编码区长 678bp，目前， 该基因已提交 Gen Bank，登录号为 EU423881。 。 将测序所得正确的 xynB 结 构基因与酵母分泌型表达载体 pPIC9K 进行连接，转化大肠杆菌 DH-5，构建 表达载体 pPIC9K-xynB。后用电击转化法将重组质粒转化毕赤酵母(Pichia pastorisGS115)，经 MM/MD 快慢斑进行筛选，并挑取数个慢斑进行甲醇诱导培 养，46 天后，将其点于 RBB-木聚糖平板上，可见产生了明显的透明圈。工程 菌 SMD-xynB-2 木聚糖酶产量达到 216U/ml，比原出发菌株提高了 2.53 倍，表 达产物具有生物学活性，分泌到细胞外，可溶且木聚糖酶的表达具有良好的遗 传稳定性。重组木聚糖酶的酶学性质与原始木聚糖酶基本相同，分别为最佳反 应温度为 50，最适 pH 约为 5.0，热稳
