《植物抗逆分子生物学专业优秀论文基于遗传图谱和生物信息学的抗旱新基因发掘》由会员分享，可在线阅读，更多相关《植物抗逆分子生物学专业优秀论文基于遗传图谱和生物信息学的抗旱新基因发掘（34页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、植物抗逆分子生物学专业优秀论文植物抗逆分子生物学专业优秀论文 基于遗传图谱和生物信息学的基于遗传图谱和生物信息学的抗旱新基因发掘抗旱新基因发掘关键词：水稻抗旱基因关键词：水稻抗旱基因 遗传图谱遗传图谱 生物信息学生物信息学 目标筛选目标筛选 基因克隆基因克隆摘要：本文利用模式植物已有的大量核酸资源与生物信息资源、技术与方法， 对水稻抗旱 QTL 区间内进行 in silico 分析，发掘目标区间内的有用信息，通 过半定量 PCR 技术对取得的核酸序列进行分析，筛选目标区间内的抗旱候选基 因。 根据本试验室已有的水稻抗旱 QTL 定位结果及已发表的抗旱定位结果， 选择水稻第 4 染色体的 RM2
2、41-RM349 标记区间为本研究目标区间，该区间包含 了与根系、叶片水分状况及产量相关的抗旱 QTL。利用 PlantQTL-GE 取得了 206 个位于目标区间内的抗旱相关 EST。其中非冗余 EST167 条。通过 PCR 扩增、克 隆测序列获得了 128 条 EST。 在苗期干旱处理 30min，3h，8h 和 20h，生长 后期中旱和重旱处理的根、叶和穗样品中，对 128 条 EST 进行半定量分析，获 得了这些 EST 在不同发育时期、不同植株部位及不同干旱胁迫程度下的表达谱。 分析结果表明： 1苗期和生长后期旱处理的根、叶和穗中上升表达的 EST 多于下降表达的 EST。目标区间
3、内的 128 条 EST 在根中产生干旱响应变化的 EST 多于叶和穗，表明此区间内大量 EST 可能与根感受土壤干旱信号有关。 2发现一些在不同的生长发育时期、不同的处理条件及不同部位均表现为上调 或下调的 EST，及在同一部位不同发育时期，同一发育时期不同部位或不同部 位不同发育时期表现相反的 EST。前者主要参与电子传递、氨基酸代谢和蛋白 质水解，与信号传递、渗透调节物质的形成有关。后者则主要参与蛋白质磷酸 化和蛋白质生物合成，涉及信号传递与干旱应激蛋白的形成。 3GO 分析结 果表明在干旱胁迫早期(苗期)及中旱(生长后期)条件下，上升与下降表达所涉 及的 EST 个数及其对应的 GO
4、类型都明显多于胁迫后期(苗期)与重旱(生长后期) 条件下涉及的 ES2、个数与 GO 类型。且产生干旱响应的：EST 可集中归于少数 几类 GO，这些 EST 可能具有的特定的功能对植株抗旱、耐早产生重要作用。 4KOBAS 分析结果表明只有 24 个基因可对应到代谢通路中。共涉及 53 种代谢 途径，主要包括 CO2 固定、糖代谢、氮代谢、次生物质代谢及信使分子代谢等。 糖代谢和氮代谢与水分胁迫下渗透调节物质的积累有关。信使分子代谢涉及鞘 脂类信使鞘氨醇-1-磷酸和肌醇磷脂信使 3 磷酸肌醇。由于定位到通路上的基因 很少，且每种通路基本只对应了一个基因，因此难以通过代谢通路来深入阐明 目的区
5、间内抗旱基因与性状的关系及抗旱基因间的关系，需要进一步的实验分 析。 5通过表达谱分析并参考前人的研究报道，选择了 12 个候选基因，其 中 2 是转录因子(GATA、GRAS)5 个为有预测功能的基因(鞘氨醇激酶、蛋白激酶、 钙依赖蛋白激酶、E3 连接酶、蛋白磷酸酶 2C)，5 个是无预测功能的基因，但 其包含的结构域(RPR、RRM、HDAC interact、FBOX/WD40)可能与转录调控及蛋 白降解有关。 克隆了鞘氨醇激酶基因(OsSphKd)和 E3 连接酶基因(OsRJNGzfl)。 鞘氨醇激酶基因密码子序列长 2247bp。序列比对分析表明其与拟南芥的 AtLCBK 相似性达
6、 70，具有该基因家族保守的催化活性位点区，在氨基酸序列上与动 物的 SphK2 基因更相似。E3 连接酶基因密码子序列长 564bp，其编码蛋白 N 端 含 3 个 TM 区，C 端有一个 RING-H2 结构，该基因与拟南芥中两个预测为 RING- H2 型的 E3 连接酶相似性达 83和 84。 在干旱、ABA、SA、JA、NaCl、Marmitol 和 Hlt;,2gt;Olt;,2gt; 处理下对 OsSphKd 和 OsRINGzfl 进行了荧光定量分析，结果表明鞘氨醇激酶基 因在叶中的表达发生了显著的变化，而在根中则变化不大，因此认为 OsSphKd 基因产生的干旱响应是叶特异的
7、，该基因可能参与了多种逆境响应。E3 连接酶 基因在叶和根中的表达都发生了变化，在叶中主要为上调表达，但其在根中的 变化较多样，因此认为 OsRINGzfl 可能存在较复杂的逆境响应方式，或是处于 逆境响应的较下游。 根据上述结果，可分别设计下一步的实验对 OsSphKd 和 OsRINGzfl 基因进行功能验证，证实 OsSphKd 基因对水稻叶片气孔的调节作 用，及该基因是如何感受干旱条件下的 ABA 信号，即该基因在干旱条件下是如 何被调控的。对于 OsRINGzfl 基因，首先应证明其是否具有 E3 连接酶活性，如 果确实是有 E3 连接酶的活性，则应确认其属单亚基连接酶还是多亚基连接
8、酶， 其特异降解的蛋白，及与干旱响应的关系等。对于本研究选出的其它基因也应 分别克隆，通过功能初探确定开展下一步的研究工作。正文内容正文内容本文利用模式植物已有的大量核酸资源与生物信息资源、技术与方法，对 水稻抗旱 QTL 区间内进行 in silico 分析，发掘目标区间内的有用信息，通过 半定量 PCR 技术对取得的核酸序列进行分析，筛选目标区间内的抗旱候选基因。根据本试验室已有的水稻抗旱 QTL 定位结果及已发表的抗旱定位结果，选择 水稻第 4 染色体的 RM241-RM349 标记区间为本研究目标区间，该区间包含了与 根系、叶片水分状况及产量相关的抗旱 QTL。利用 PlantQTL-
9、GE 取得了 206 个 位于目标区间内的抗旱相关 EST。其中非冗余 EST167 条。通过 PCR 扩增、克隆 测序列获得了 128 条 EST。 在苗期干旱处理 30min，3h，8h 和 20h，生长后 期中旱和重旱处理的根、叶和穗样品中，对 128 条 EST 进行半定量分析，获得 了这些 EST 在不同发育时期、不同植株部位及不同干旱胁迫程度下的表达谱。 分析结果表明： 1苗期和生长后期旱处理的根、叶和穗中上升表达的 EST 多于下降表达的 EST。目标区间内的 128 条 EST 在根中产生干旱响应变化的 EST 多于叶和穗，表明此区间内大量 EST 可能与根感受土壤干旱信号有关
10、。 2发现一些在不同的生长发育时期、不同的处理条件及不同部位均表现为上调 或下调的 EST，及在同一部位不同发育时期，同一发育时期不同部位或不同部 位不同发育时期表现相反的 EST。前者主要参与电子传递、氨基酸代谢和蛋白 质水解，与信号传递、渗透调节物质的形成有关。后者则主要参与蛋白质磷酸 化和蛋白质生物合成，涉及信号传递与干旱应激蛋白的形成。 3GO 分析结 果表明在干旱胁迫早期(苗期)及中旱(生长后期)条件下，上升与下降表达所涉 及的 EST 个数及其对应的 GO 类型都明显多于胁迫后期(苗期)与重旱(生长后期) 条件下涉及的 ES2、个数与 GO 类型。且产生干旱响应的：EST 可集中归
11、于少数 几类 GO，这些 EST 可能具有的特定的功能对植株抗旱、耐早产生重要作用。 4KOBAS 分析结果表明只有 24 个基因可对应到代谢通路中。共涉及 53 种代谢 途径，主要包括 CO2 固定、糖代谢、氮代谢、次生物质代谢及信使分子代谢等。 糖代谢和氮代谢与水分胁迫下渗透调节物质的积累有关。信使分子代谢涉及鞘 脂类信使鞘氨醇-1-磷酸和肌醇磷脂信使 3 磷酸肌醇。由于定位到通路上的基因 很少，且每种通路基本只对应了一个基因，因此难以通过代谢通路来深入阐明 目的区间内抗旱基因与性状的关系及抗旱基因间的关系，需要进一步的实验分 析。 5通过表达谱分析并参考前人的研究报道，选择了 12 个候
12、选基因，其 中 2 是转录因子(GATA、GRAS)5 个为有预测功能的基因(鞘氨醇激酶、蛋白激酶、 钙依赖蛋白激酶、E3 连接酶、蛋白磷酸酶 2C)，5 个是无预测功能的基因，但 其包含的结构域(RPR、RRM、HDAC interact、FBOX/WD40)可能与转录调控及蛋 白降解有关。 克隆了鞘氨醇激酶基因(OsSphKd)和 E3 连接酶基因(OsRJNGzfl)。 鞘氨醇激酶基因密码子序列长 2247bp。序列比对分析表明其与拟南芥的 AtLCBK 相似性达 70，具有该基因家族保守的催化活性位点区，在氨基酸序列上与动 物的 SphK2 基因更相似。E3 连接酶基因密码子序列长 5
13、64bp，其编码蛋白 N 端 含 3 个 TM 区，C 端有一个 RING-H2 结构，该基因与拟南芥中两个预测为 RING- H2 型的 E3 连接酶相似性达 83和 84。 在干旱、 ABA、SA、JA、NaCl、Marmitol 和 Hlt;,2gt;Olt;,2gt; 处理下对 OsSphKd 和 OsRINGzfl 进行了荧光定量分析，结果表明鞘氨醇激酶基 因在叶中的表达发生了显著的变化，而在根中则变化不大，因此认为 OsSphKd 基因产生的干旱响应是叶特异的，该基因可能参与了多种逆境响应。E3 连接酶基因在叶和根中的表达都发生了变化，在叶中主要为上调表达，但其在根中的 变化较多样
14、，因此认为 OsRINGzfl 可能存在较复杂的逆境响应方式，或是处于 逆境响应的较下游。 根据上述结果，可分别设计下一步的实验对 OsSphKd 和 OsRINGzfl 基因进行功能验证，证实 OsSphKd 基因对水稻叶片气孔的调节作 用，及该基因是如何感受干旱条件下的 ABA 信号，即该基因在干旱条件下是如 何被调控的。对于 OsRINGzfl 基因，首先应证明其是否具有 E3 连接酶活性，如 果确实是有 E3 连接酶的活性，则应确认其属单亚基连接酶还是多亚基连接酶， 其特异降解的蛋白，及与干旱响应的关系等。对于本研究选出的其它基因也应 分别克隆，通过功能初探确定开展下一步的研究工作。
15、本文利用模式植物已有的大量核酸资源与生物信息资源、技术与方法，对水稻 抗旱 QTL 区间内进行 in silico 分析，发掘目标区间内的有用信息，通过半定 量 PCR 技术对取得的核酸序列进行分析，筛选目标区间内的抗旱候选基因。 根据本试验室已有的水稻抗旱 QTL 定位结果及已发表的抗旱定位结果，选择水 稻第 4 染色体的 RM241-RM349 标记区间为本研究目标区间，该区间包含了与根 系、叶片水分状况及产量相关的抗旱 QTL。利用 PlantQTL-GE 取得了 206 个位 于目标区间内的抗旱相关 EST。其中非冗余 EST167 条。通过 PCR 扩增、克隆测 序列获得了 128
16、条 EST。 在苗期干旱处理 30min，3h，8h 和 20h，生长后期 中旱和重旱处理的根、叶和穗样品中，对 128 条 EST 进行半定量分析，获得了 这些 EST 在不同发育时期、不同植株部位及不同干旱胁迫程度下的表达谱。分 析结果表明： 1苗期和生长后期旱处理的根、叶和穗中上升表达的 EST 多 于下降表达的 EST。目标区间内的 128 条 EST 在根中产生干旱响应变化的 EST 多于叶和穗，表明此区间内大量 EST 可能与根感受土壤干旱信号有关。 2发现一些在不同的生长发育时期、不同的处理条件及不同部位均表现为上调 或下调的 EST，及在同一部位不同发育时期，同一发育时期不同部位或不同部 位不同发育时期表现相反的 EST。前者主要参与电子传递、氨基酸代谢和蛋白 质水解，与信号传递、渗透调节物质的形成有关。后者则主要参与蛋白质磷酸 化和蛋白质生物合成，涉及信号传递与干旱应激蛋白的形成。 3GO 分析结 果表明在干旱
