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1、免疫学专业优秀论文免疫学专业优秀论文 新的细胞亚群新的细胞亚群 Th17Th17 在动脉粥样硬化形成中的在动脉粥样硬化形成中的作用作用关键词：动脉粥样硬化关键词：动脉粥样硬化 急性冠状动脉综合症急性冠状动脉综合症 细胞亚群细胞亚群 发病机制发病机制摘要：目的： 动脉粥样硬化引起的急性冠状动脉综合症已经成为严重影响我 国中老年人健康的常见疾病，并有逐年递增趋势，但由于其发病机制尚不清楚 对其防治带来困难。近年来研究认为动脉粥样硬化是一种自身免疫病，多种免 疫细胞（巨噬细胞、T 细胞）和细胞因子参与了疾病的发生和发展，特别是 CD4+T 细胞在动脉粥样硬化中的作用引起了关注。CD4+T 细胞是一类
2、异源性群体， 受抗原刺激后在不同的细胞因子作用下可分化为不同的亚群，包括传统的 Th1 和 Th2，以及新近发现的 Th17 细胞和调节性 T 细胞（regulatoryT cells，Treg） 。目前，不同 CD4+T 细胞亚群在动脉粥样硬化中的作用尚不清楚。 有资料显示 Th1 具有促进斑块形成的作用，Th2 在斑块形成中的作用尚存在争 议。近年来，有两个研究小组认为 CD4+CD25+Foxp3+T 细胞在动脉粥样硬化的形 成中起到保护性的作用，但 Th17 在动脉粥硬化斑块中的作用尚不清楚。 Th17 是以分泌 IL-17 为主要特征的 CD4+T 细胞群体，在体外，CD4+初始 T
3、 细胞 受抗原刺激后在 IL-6 和 TGF- 的作用下可以促使 Th0 分化成为 Th17 细胞，控 制其分化的转录因子是 RORt。目前研究发现 Th17 细胞在多种自身免疫性疾 病中发挥重要的促进作用。 为了明确 T 细胞亚群与动脉粥样硬化发生、发展 的关系，以及 Th17 细胞亚群对动脉粥样硬化形成的影响，本论文从以下四个方 面进行了研究： 一、动脉粥样硬化斑块模型的建立及斑块的形成过程； 二、动脉粥样硬化斑块的形成发生过程中不同 Th 亚群的变化； 三、动脉粥 样硬化斑块的形成发生过程中相关细胞因子和转录因子的变化； 四、 Th17/IL-17 在动脉粥样硬化形成中的确切作用。 方法
4、： 一、动脉粥样硬 化小鼠模型的建立 1.ApoE-/-小鼠 8 周开始给予高脂饲料喂养，10 周行左侧 颈动脉套管缩窄手术（加速斑块的形成） ，然后继续高脂喂养分别至 16 和 24 周。2.取不同周龄小鼠左侧颈动脉制备连续冰冻切片，HE 染色和油红 O 染色检 测不同周龄小鼠颈动脉斑块形成情况和斑块局部脂质沉积情况。 3.RT-PCR 检测斑块局部相关炎性因子的表达情况。 二、动脉粥样硬化的发生过程中 Th1，Th17 和 Treg 细胞的变化规律 1.分别取未形成动脉粥样硬化斑块、动 脉粥样硬化斑块早期和晚期小鼠的脾脏制备脾细胞悬液，进行多种标记。 2. 流式细胞术检测小鼠脾脏中 Th1
5、，Th17 和 Treg 细胞的比例变化。 三、斑块 局部相关炎性因子和转录因子的检测 1.分别取未形成动脉粥样硬化斑块、动 脉粥样硬化斑块早期和晚期小鼠的颈动脉和主动脉弓。 2.RT-PCR 检测小鼠 动脉粥样硬化斑块局部相关炎性因子（IFN-、IL-17）和转录因子（T- bet、RORt）的表达情况。 四、IL-17 产生细胞对动脉粥样硬化斑块形成 的影响 1.ApoE-/-小鼠 20 只，随机分成两组，8 周开始给予高脂饲料喂养， 10 周行左侧颈动脉套管缩窄手术。 2.套管 5 天后给 ApoE-/-小鼠腹腔注射中 和性 IL-17 抗体，对照组同时腹腔注射同型对照。 3.微型活体超
6、声检测颈动 脉形成的斑块大小。 4.取小鼠左侧颈动脉制备连续冰冻切片，HE 染色和油 红 O 染色检测小鼠颈动脉斑块的大小。 结果： 一、动脉粥样硬化斑块模 型的建立及斑块的形成过程 （一）颈动脉动脉粥样硬化斑块的形成 为了研究不同 T 细胞亚群在粥样硬化斑块形成中的作用，我们首先利用 ApoE-/-小鼠 建立了快速颈动脉粥样硬化斑块模型。ApoE-/-小鼠从 8 周开始给予高脂饲料喂 养，10 周给予颈动脉套管加速斑块的形成，至小鼠 16 周和 24 周后，处死小鼠 取颈动脉制备冰冻切片并进行 HE 染色和油红 O 染色。结果发现，ApoE-/-模型 小鼠 8 周时，血管壁仅出现增厚但没有斑
7、块的形成：到达 16 周时，血管内膜有 明显的斑块形成，此时，斑块纤维帽较厚，浸润的细胞较多，平滑肌细胞明显 增多，含有大量的胶原成分和脂质，属于纤维斑块期，即早期斑块；到达 24 周 时，斑块的纤维帽明显变薄，胶原和平滑肌细胞减少，脂质含量明显增多，为 粥样斑块期，即晚期斑块。同龄的野生型 C57BL/6 细胞在整个观察过程中没有 斑块形成。 （二）斑块局部粘附分子和细胞因子的变化 为了证实斑块中有 炎性免疫反应的存在，我们用 RT-PCR 的方法检测了已经形成斑块的主动脉弓和 颈动脉中相关粘附分子和炎性细胞因子的表达情况，结果发现血管粘附分子- 1（VCAM-1）以及 IL-12 和 TN
8、F- 在斑块形成后表达明显升高。 二、动脉粥 样硬化斑块的形成发生过程中不同 Th 亚群的变化 （一）调节性 T 细胞 （Tregs）在斑块形成过程中的变化 为了研究调节性 T 细胞随动脉粥样硬化 斑块形成的变化规律，我们采用流式细胞术检测了 8 周、16 周、24 周小鼠脾细 胞中调节性 T 细胞的比例，结果发现 CD4+Foxp3+T 细胞从未形成斑块到形成斑 块的整个过程中均高于对照组，其中主要是 CD4+ Foxp3+ CD25-T 细胞亚群升高， 而 CD4+ Foxp3+ CD25+T 细胞无明显的变化。此外，我们还发现无论是 ApoE-/- 模型小鼠还是 C57BL/6 正常小鼠
9、脾脏中 CD4+CD25+Foxp3+T 细胞的比例均随年龄 的增长呈现下降的趋势，而 CD4+CD25-Foxp3+T 细胞的比例呈明显上升的趋势。 提示这两群调节性 T 细胞亚群在动脉粥样硬化和衰老中扮演着不同角色，但具 体作用有待进一步研究（已经获得国家自然基金资助） （二）Th1 和 Th17 细 胞在斑块形成过程中的变化 为了研究 Th17 细胞在动脉粥样斑块形成过程中 的作用以及与 Th1 细胞的关系，我们分别取无斑块（8 周） 、早期斑块（16 周） 和晚期斑块（24 周）小鼠的脾脏制备脾细胞悬液，采用胞内流式细胞染色方法 检测 Th1（CD4+IFN-+T）细胞和 Th17（C
10、D4+IL-17+T）细胞的数量，结果发现 在无斑块形成时，Th1 和 Th17 数量较同龄的野生型小鼠无明显改变，当小鼠有 斑块形成时（16 周和 24 周） ，Th1 和 Th17 细胞的比例较对照组均明显升高，且 与斑块的大小呈正比，提示 Th17 细胞与 Th1 细胞均参与动脉粥样斑块的形成。 三、动脉粥样硬化斑块的形成过程中相关细胞因子和转录因子的变化 为了进 一步证实 Th1 和 Th17 细胞确实存在在动脉粥样硬化斑块局部发挥作用，分别取 无斑块（8 周） 、早期斑块（16 周）和晚期斑块（24 周）小鼠的颈动脉和主动 脉弓部抽提 RNA，采用 RT-PCR 的方法检测 RORt
11、、T-bet 和 IFN-、IL-17 在 斑块中的表达情况，结果发现相应的转录因子在斑块形成早期和晚期的表达均 较对照组明显升高；另外，在 ApoE-/-小鼠 16 周时 IFN- 和 IL-17 的表达均 明显上调，而在斑块形成的晚期则表达降低，进一步证实了 Th1 和 Th17 细胞均 参与了动脉粥样硬化的发生。 四、Th17/IL-17 在动脉粥样硬化形成中的确 切作用 IL-17 是 Th17 细胞的主要效应分子，为了证实 Th17 细胞在动脉粥 样硬化斑块形成中的作用，我们给 ApoE-/-模型小鼠腹腔注射抗 IL-17 的中和 性抗体用以中和 IL-17 的作用，进一步采用小鼠微
12、超声成像和病理学方法观察 抗体干预对斑块形成的影响。结果发现 9 只对照组小鼠左侧颈动脉均有较大斑 块的形成，而小鼠体内注射中和性 IL-17 抗体组，10 只小鼠中仅有一只出现了 较小的斑块，其他小鼠几乎没有斑块的形成，这就说明产生 IL-17 的 Th17 细胞具有促进动脉粥样硬化斑块形成的作用，以此为靶点进行干预对动脉粥样硬化 的治疗有重要价值。 结论： 1.不同 Th 亚群在动脉斑块的形成过程中均发 生了改变 （1）CD4+Foxp3+调节性 T 细胞（Tregs）在斑块形成过程中比例上 调，其中主要是 CD4+ Foxp3+ CD25-T 细胞亚群升高，而 CD4+ Foxp3+ C
13、D25+T 细胞无明显的变化，提出 CD4+ Foxp3+ CD25-T 细胞亚群可能具有正向调节作用， 但具体作用有待进一步研究。 （已经获得国家自然基金资助） （2）Th1 和 Th17 细胞在斑块形成后明显升高，且与动脉粥样硬化斑块的大小成正比，另外， 斑块局部 Th1 和 Th17 相关的转录因子和细胞因子升高，提示 Th17 和 Th1 细胞 均参与了动脉粥样硬化的形成。 2.用中和抗体阻断 Th17 的主要效应分子 IL-17 的作用可明显抑制斑块的形成，证明 Th17 具有促进动脉粥样硬化斑块形 成的作用。 创新性和意义： 1.本研究的创新点在于观察了随斑块形成 T 细胞亚群的变
14、化规律，发现了在斑块形成的早期 Th1 和 Th17 细胞即有升高的现 象，通过体内试验首先发现了 IL-17 的主要产生细胞 Th17 具有促进动脉粥样硬 化斑块的形成，为进一步的研究动脉粥样硬化早期的形成机制提供了新的视点， 并为以 Th17/IL-17 作为靶点应用于临床治疗提供了第一手资料。 2.调节性 T 细胞在斑块形成过程中也有明显的变化，并发现了一群 CD4+CD25-Foxp3+T 细 胞的上调，这为研究调节性 T 细胞在动脉粥样硬化疾病中的作用提出了新的问 题。 研究的局限性： 1.鉴于用小鼠做动脉粥样硬化疾病模型，颈动脉形 成的斑块较小，使得进一步进行局部研究受到一定的限制
15、。正文内容正文内容目的： 动脉粥样硬化引起的急性冠状动脉综合症已经成为严重影响我国 中老年人健康的常见疾病，并有逐年递增趋势，但由于其发病机制尚不清楚对 其防治带来困难。近年来研究认为动脉粥样硬化是一种自身免疫病，多种免疫 细胞（巨噬细胞、T 细胞）和细胞因子参与了疾病的发生和发展，特别是 CD4+T 细胞在动脉粥样硬化中的作用引起了关注。CD4+T 细胞是一类异源性群体，受 抗原刺激后在不同的细胞因子作用下可分化为不同的亚群，包括传统的 Th1 和 Th2，以及新近发现的 Th17 细胞和调节性 T 细胞（regulatoryT cells，Treg） 。 目前，不同 CD4+T 细胞亚群在
16、动脉粥样硬化中的作用尚不清楚。有资料显示 Th1 具有促进斑块形成的作用，Th2 在斑块形成中的作用尚存在争议。近年来， 有两个研究小组认为 CD4+CD25+Foxp3+T 细胞在动脉粥样硬化的形成中起到保护 性的作用，但 Th17 在动脉粥硬化斑块中的作用尚不清楚。 Th17 是以分泌 IL-17 为主要特征的 CD4+T 细胞群体，在体外，CD4+初始 T 细胞受抗原刺激后 在 IL-6 和 TGF- 的作用下可以促使 Th0 分化成为 Th17 细胞，控制其分化的转 录因子是 RORt。目前研究发现 Th17 细胞在多种自身免疫性疾病中发挥重要 的促进作用。 为了明确 T 细胞亚群与动脉粥样硬化发生、发展的关系，以及 Th17 细胞亚群对动脉粥样硬化形成的影响，本论文从以下四个方面进行了研究：一、动脉粥样硬化斑块模型的建立及斑块的形成过程；
