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1、影像医学与核医学专业优秀论文影像医学与核医学专业优秀论文 新生兔缺氧缺血性脑损伤细胞凋新生兔缺氧缺血性脑损伤细胞凋亡的基础与影像学实验研究亡的基础与影像学实验研究关键词：细胞凋亡关键词：细胞凋亡 放射性核素显像放射性核素显像 磁共振磁共振 弥散成像弥散成像 新生儿缺氧缺血性脑损新生儿缺氧缺血性脑损 伤伤摘要：新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是由 于新生儿窒息，引起脑血供和气体交换障碍所致的一种全脑性损伤，是严重危 害新生儿生命健康的疾病，有较高的发病率和死亡率，也是造成儿童智能低下、 脑瘫等神经系统残疾的重要原因之一。HIBD 的发
2、病原因及发病机制较为复杂， 越来越多的证据表明，细胞凋亡(Apoptosis)也参与 HIBD，并在其中发挥独特 的作用。神经元细胞凋亡的发生与患儿的预后有着密切的联系。 本实验通过 建立新生兔缺氧缺血性脑损伤模型，对损伤后不同时间点各组动物患侧脑组织 进行病理组织学光镜、电镜动态观察，利用 TUNEL 染色和免疫组织化学手段观 察脑组织中凋亡细胞及其调控蛋白的动态表达规律，并应用 Tc-HYNIC-Annexin 进行活体放射性核素凋亡显像，探讨新生兔缺氧缺血性脑损伤神经元凋亡的 形态学动态变化、凋亡调控蛋白动态表达规律及其活体核素凋亡显像的可行性， 为新生儿缺氧缺血性脑损伤神经元凋亡的基础
3、与影像学研究提供动物实验依据。一、实验动物 新生 810 天健康日本大耳白兔，雌雄不限，体重 100120g，由中国医科大学附属第二医院实验动物部提供。 二、实验试剂 5盐酸利多卡因，2O乌拉坦(氨基甲酸乙酯)，乙醚，医用纯氧气和纯氮气， 4多聚甲醛溶液，0.1M 磷酸缓冲液，过氧化氢，不同浓度酒精，二甲苯，中 性树胶。TTC(红四氮唑)，2.5戊二醛，1锇酸，Epon812(环氧树脂)(论文一)； 兔抗兔 Bcl-2 和 Bax 多克隆抗体(一抗)、SABC 试剂盒、TUNEL 试剂盒和 DAB 染 色液(论文二)； lt;#39;99mgt;TcOlt;,4gt;lt;#39;- gt;，
4、Annenxin V，Snlt;#39;2+gt;-Fricine Kit 和 HYNIC(联肼尼克酰胺)-Annexin V Kit(论文三)。 三、实验仪器 缺氧箱， 石蜡切片机，电子天平(ER-185A)，Olympus 光学显微镜，JEM-1200EX 电镜， CY-100 数字测氧仪，GE Infinia lt;#39;VCgt; Hawkeye 双探 头 SPECT/CT，Philip 3.0 T 磁共振。 实验方法: 论文一：按上述方法制 备新生兔缺氧缺血性脑损伤模型，将实验动物按缺氧缺血后不同时间点分成 6 组：(1)假手术对照组 n=7；(2)HIBD 1h 组 n=5；(3
5、)HIBD 4h 组：n=5；(4)HIBD 12h 组 n=5；(5)HIBD 24h 组 n=5；(6)HIBD 48h 组 n=7。观察各组实验动物处理 过程中的行为变化情况；到达规定时间后，各组动物经 4多聚甲醛心脏灌流 后断头取脑，取脑时观察脑组织大体标本情况；取假手术组和 HIBD 48h 组动物 各 2 只断头取脑行 TTC 染色，观察有无肉眼可见的梗死灶；每组 3 只动物脑组 织标本常规脱水、透明、石蜡包埋，冠状切片、片厚 5m，制作 HE 染色切片， 观察右侧脑组织光镜病理学变化；每组 2 只动物取右侧大脑皮质、海马和小脑 皮质，脑组织标本经 2.5戊二醛固定、1锇酸固定、酒
6、精梯度脱水、 Epon812 包埋、超薄切片，透视电镜下摄片，观察脑组织超微结构变化。 论 文二：制备新生兔缺氧缺血性脑损伤模型，将实验动物分成 6 组：(1)假手术对 照组 n=5；(2)HIBD 1h 组 n=5；(3)HIBD 4h 组 n=5；(4)HIBD 12h 组 n=5；(5)HIBD 24h 组 n=5；(6)HIBD 48h 组 n=5。各组动物经 4多聚甲醛心脏灌流后断 头取脑，常规脱水、透明和石蜡包埋。各组取右侧丘脑中 1/3 平面、小脑位置 行冠状切片，切片厚度为 5pm，进行 TUNEL、Bcl-2 和 Bax 蛋白免疫组化检测， 光镜下观察凋亡细胞、Bcl-2 和
7、 Bax 蛋白在各部位动态分布。 论文三：制备 新生兔缺氧缺血性脑损伤模型，将实验动物分成 6 组：(1)假手术对照组 n=5；(2)HIBD 1h 组 n=5；(3)HIBD 4h 组 n=5；(4)HIBD 12h 组 n=5；(5)HIBD 24h 组 n=5；(6)HIBD48h 组 n=5。制备lt;#39;99mgt;Tc- HYNIC-Annexin V，各组实验动物注射显像剂后 1h 进行 SPECT 平面活体凋亡显 像；HIBD 48h 组动物还分别在注药后 5min、30min、60min 和 120min 显像；取 HIBD 48h 组两只动物，在活体显像之后，断头取脑进
8、行裸脑离体显像。 实 验结果: 论文一：实验组动物缺血缺氧处理后 5 min 出现烦躁不安，20 min 时出现呼吸加深加快，鼻翼煽动，40 min 至 90 min 时出现嗜睡，爬行时左后 肢呈拖步，90min 至 2.5 h 时嗜睡明显，部分动物出现短暂性抽搐；假手术组 动物活动状态无明显改变。假手术对照组、HIBD 1h 组、HIBD 4h 组两侧大小脑 半球未见明显异常改变，HIBD 12h 组可见右侧大小脑半球与对侧相比，颜色苍 白，呈轻度肿胀，软脑膜下见轻度出血改变，HIBD 24h 组和 HIBD 48h 组见右 侧大小脑半球肿胀明显，颜色较苍白，软脑膜下出血征象明显，而对侧大小
9、脑 半球未见明显异常。电镜超微结构形态学观察：小脑皮质最先在 HIBD 1h 出现 凋亡征象，其次为大脑皮质在 HIBD 12h、海马 CA1 区在 HIBD 24h 出现凋亡细 胞超微结构明显改变，随损伤时程进展各部位细胞超微结构改变明显，细胞器 损伤加重。 论文二：TUNEL 法检测 HIBD 后不同时间点凋亡细胞的动态变化， 光镜下分别观察并计数各组 TUNEL 法染色切片，标记阳性细胞的细胞核着棕黄 色，胞浆不着色。假手术对照组大脑皮质、海马区和小脑皮质未见明显 TUNEL 标记阳性细胞表达；患侧大脑皮质在 HIBD 12h TUNEL 标记阳性细胞表达明显； 患侧海马 CA1 区在
10、HIBD 24h TUNEL 标记阳性细胞表达明显；患侧小脑皮质在 HIBD 4hTUNEL 标记阳性细胞表达明显。缺氧缺血后时间随时间推移阳性标记细 胞逐渐增多，至 HIBD 48 h 各部位阳性标记细胞数达到最多。 (一)免疫组织 化学检测 Bcl-2 蛋白表达情况假手术对照组患侧大脑皮质、海马区和小脑皮质 未见明显 Bcl-2 蛋白表达；患侧大脑皮质在 HIBD 4h Bcl-2 蛋白表达明显(阳性 表达细胞计数为 88.41.9)，于 HIBD 48h 表达明显减少；患侧海马 CA1 区在 HIBD 4h Bcl-2 蛋白表达明显(阳性表达细胞计数为 73.63.2)，于 HIBD 4
11、8h 表达明显减少；患侧小脑皮质在 HIBD 1h Bcl-2 蛋白表达明显(阳性表达细胞计 数为 93.65.08)，于 HIBD 48h 表达明显减少，P 均lt;0.05。 (二)免 疫组织化学检测 Bax 蛋白表达情况假手术对照组患侧大脑皮质、海马区和小脑 皮质未见明显 Bax 蛋白表达；患侧大脑皮质 Bax 蛋白在 HIBD 1h 表达较少，在 HIBD 12h 表达明显增多(阳性表达细胞计数为 65.614.3)；患侧海马 CA1 区 Bax 蛋白表达在 HIBD 1h 表达较少，在 HIBD 24h 表达明显增多(阳性表达细胞 计数为 76.412.0)；患侧小脑皮质 Bax 蛋
12、白在 HIBD 1h 表达较少，在 HIBD 4h 表达明显增多(阳性表达细胞计数为 536.7)；缺氧缺血后随时间推移，HIBD 48h 时各部位阳性标记细胞数达到最多，P 均lt;0.05。 论文三：假手 术组动物lt;#39;99mgt;Tc-HYNIC-Annexin V 活体凋亡显像未 发现两侧大脑区域有异常放射性浓聚，HIBD 4h 组动物显像发现右侧大脑(患侧)局 限性放射性轻度浓聚，而对侧呈放射性本底影；HIBD 48h 组右侧大脑见明显放 射性异常浓聚，对侧未见异常放射性分布；HIBD 48h 组裸脑离体核素凋亡显像仅见右侧大脑放射性浓聚明显，左侧大脑呈放射性空白分布。 结论
13、: 论文 一： 1对新生兔结扎一侧颈总动脉，给予低氧处理后，可制作成患侧缺氧 缺血性脑损伤模型； 2本研究动物模型属于轻度脑缺氧血性脑损伤模型， 观察处理后 48h 尚未造成患侧大脑明显梗死； 3病理学动态观察发现患侧 小脑皮质对缺氧缺血较为明显，其次为大脑皮质和海马区，上述区域存在凋亡 细胞，随损伤后时间推移而明显。 4电镜超微结构动态观察发现患侧小脑 皮质在损伤因素后较早出现细胞凋亡超微结构改变，其次为大脑皮质和海马， 电镜可清晰显示各部位损伤后细胞核和细胞器的形态学改变。 论文二： 1在新生兔 HIBD 模型中，患侧小脑细胞凋亡较早发生，其次为大脑和海马， 缺氧缺血后时间随时间推移凋亡细
14、胞数明显增多。 2在新生兔 HIBD 模型中， 患侧大脑皮质、海马、小脑皮质在 HIBD 损伤早期 Bcl-2 蛋白表达明显，但于 HIBD 48h 表达明显减少，而 Bax 蛋白表达明显增多，其中小脑 Bax 蛋白表达明 显较早出现，其次为大脑和海马。 论文三： 1核素凋亡显像剂 lt;#39;99mgt;Tc-HYNIC-Annexin V 在新生兔 HIBD 损伤后 4h 即可出现患侧放射性异常浓聚，提示神经元凋亡的存在；而脑部 MRI 常规和弥 散成像在 HIBD 4h 未发现异常。 2利用lt;#39;99mgt;Tc- HYNIC-Annexin V 显像可以对 HIBD 损伤后细
15、胞凋亡状况进行动态、半定量观察。3对于脑部lt;#39;99mgt;Tc-HYNIC-Annexin V 凋亡显像， 注射药物后 5min 显像与注药后 2h 显像放射性分布并无明显差别，提示脑部凋 亡显像早期即可进行。正文内容正文内容新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是由于 新生儿窒息，引起脑血供和气体交换障碍所致的一种全脑性损伤，是严重危害 新生儿生命健康的疾病，有较高的发病率和死亡率，也是造成儿童智能低下、 脑瘫等神经系统残疾的重要原因之一。HIBD 的发病原因及发病机制较为复杂， 越来越多的证据表明，细胞凋亡(Apoptosi
16、s)也参与 HIBD，并在其中发挥独特 的作用。神经元细胞凋亡的发生与患儿的预后有着密切的联系。 本实验通过 建立新生兔缺氧缺血性脑损伤模型，对损伤后不同时间点各组动物患侧脑组织 进行病理组织学光镜、电镜动态观察，利用 TUNEL 染色和免疫组织化学手段观 察脑组织中凋亡细胞及其调控蛋白的动态表达规律，并应用 Tc-HYNIC-Annexin 进行活体放射性核素凋亡显像，探讨新生兔缺氧缺血性脑损伤神经元凋亡的 形态学动态变化、凋亡调控蛋白动态表达规律及其活体核素凋亡显像的可行性， 为新生儿缺氧缺血性脑损伤神经元凋亡的基础与影像学研究提供动物实验依据。一、实验动物 新生 810 天健康日本大耳白兔，雌雄不限，体重 100120g，由中国医科大学附属第二医院实验动物部提供。 二、实验试剂 5盐酸利多卡因，2O乌拉坦(氨基甲酸乙酯)，乙醚，医用纯氧气和纯氮气， 4多聚甲
