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1、遗传学专业优秀论文遗传学专业优秀论文 新型牛溶菌酶基因的重组真核质粒构建及活新型牛溶菌酶基因的重组真核质粒构建及活性研究性研究关键词：牛溶菌酶基因关键词：牛溶菌酶基因 真核质粒真核质粒 基因重组基因重组 基因表达基因表达 抗菌活性抗菌活性摘要：溶菌酶(lysozyme，LYZ)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解细菌细胞 壁中粘多糖 -1，4-糖苷键的胞壁质酶，是一种碱性蛋白质，存在于许多动物、 植物和微生物中。研究发现，溶菌酶对革兰氏阳性细菌具有直接的溶解作用， 催化革兰氏阳性菌细胞壁不溶性多糖水解，生成可溶性黏肽。在分泌型免疫球 蛋白 A 和补体的参与下，溶菌酶还对革兰氏阴性细菌具有间接的溶
2、解作用，是 一种天然的抗菌物质。由于其能够增强巨噬细胞和白细胞的吞噬和消化功能、 将诱发炎症的酸性物质灭活、增强抗菌素及其它药物的疗效，具有消炎消肿、 帮助组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等药理作用，因此溶菌酶在 医疗界中倍受关注。近年来，随着生物学技术和免疫学技术的发展，对溶菌酶 的研究取得了令人瞩目的成就。利用 DNA 重组技术发展溶菌酶的抗菌效果，已 成为其中重要的研究方向。 牛体内溶菌酶(bovine lysozyme，bLys)有大约 10 种，表达的潜在位点有：乳腺、唾液、泪液、胃、气管组织以及中性粒细胞、 嗜红细胞、巨噬细胞、白细胞等。由于牛奶与人们的生活息息相关，其质量
3、的 好坏关系着人们的健康，因此，对牛奶溶菌酶的研究尤为突出。为构建具有高 效抗菌、活性持久的抗菌基因，探索研制新型抗菌制剂，克服耐药性细菌感染 日益严重的问题，本实验构建了原核表达载体 pGEX-4T-1-Lys(pGL)。本实验是 以成功构建的新型牛溶菌酶基因原核表达载体 pGL 为模板，用 PCR 扩增得到目 的片段 Lys 基因，将 VR1020 和目的片段 Lys 分别用 BamHI 和 Bgl双酶切，并 将 VR1020 酶切片段先进行去磷酸化，然后将两种酶切产物在 16水浴过夜连 接；连接产物转化大肠杆菌 DH5a 感受态细胞，筛选重组子，用碱裂解法小规模 提取重组子质粒 DNA，
4、用BamHI，Bgl作双酶切鉴定验证，并作质粒 PCR 鉴 定。经双酶切和质粒 PCR 的实验结果初步确定的阳性重组子进行双向基因测序， 测序结果证明插入目的片段正确，证实新型牛溶菌酶基因已经克隆到真核表达 载体 VR1020(VR1020-Lys，命名为 VRL)上。将重组质粒 VRL 以 JetPEIlt;#39;TMgt; Cationic polymer 分子包裹，介导转染 真核 HEK293 细胞，转染培养 24h、48h、72h 后分别提取培养细胞 mRNA 进行 RT-PCR，与 VR1020 转染细胞比较发现，转染后 24h、48h 和 72h 的 HEK293 细胞 的 RN
5、A 中含有与目的 cDNA 片段对应的 mRNA。为了探索一种更经济高效的转染 介质，本实验同时还制备了壳聚糖纳米颗粒(chitosan nanoparticles，CNP)， 用此壳聚糖纳米颗粒包裹重组质粒 VRL 后转染 HEK293 细胞，转染的 HEK293 细 胞中也表达与目的 cDNA 片段对应的 mRNA，说明了壳聚糖纳米颗粒也能作为一 种有效的转染介质。用转染后 HEK293 细胞上清分别作抑制标准大肠杆菌、产毒 性大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎球菌生长实验，实验结果证明 新构建的真核表达质粒 VRL 具有良好的抑制革兰氏阳性菌生长的效果，这些为 深入开展 VRL 在
6、动物体内的抗感染抑菌实验奠定了可靠的基础。正文内容正文内容溶菌酶(lysozyme，LYZ)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解细菌细胞壁 中粘多糖 -1，4-糖苷键的胞壁质酶，是一种碱性蛋白质，存在于许多动物、 植物和微生物中。研究发现，溶菌酶对革兰氏阳性细菌具有直接的溶解作用， 催化革兰氏阳性菌细胞壁不溶性多糖水解，生成可溶性黏肽。在分泌型免疫球 蛋白 A 和补体的参与下，溶菌酶还对革兰氏阴性细菌具有间接的溶解作用，是 一种天然的抗菌物质。由于其能够增强巨噬细胞和白细胞的吞噬和消化功能、 将诱发炎症的酸性物质灭活、增强抗菌素及其它药物的疗效，具有消炎消肿、 帮助组织修复、改善组织局部血液循环
7、和分解脓液等药理作用，因此溶菌酶在 医疗界中倍受关注。近年来，随着生物学技术和免疫学技术的发展，对溶菌酶 的研究取得了令人瞩目的成就。利用 DNA 重组技术发展溶菌酶的抗菌效果，已 成为其中重要的研究方向。 牛体内溶菌酶(bovine lysozyme，bLys)有大约 10 种，表达的潜在位点有：乳腺、唾液、泪液、胃、气管组织以及中性粒细胞、 嗜红细胞、巨噬细胞、白细胞等。由于牛奶与人们的生活息息相关，其质量的 好坏关系着人们的健康，因此，对牛奶溶菌酶的研究尤为突出。为构建具有高 效抗菌、活性持久的抗菌基因，探索研制新型抗菌制剂，克服耐药性细菌感染 日益严重的问题，本实验构建了原核表达载体
8、pGEX-4T-1-Lys(pGL)。本实验是 以成功构建的新型牛溶菌酶基因原核表达载体 pGL 为模板，用 PCR 扩增得到目 的片段 Lys 基因，将 VR1020 和目的片段 Lys 分别用 BamHI 和 Bgl双酶切，并 将 VR1020 酶切片段先进行去磷酸化，然后将两种酶切产物在 16水浴过夜连 接；连接产物转化大肠杆菌 DH5a 感受态细胞，筛选重组子，用碱裂解法小规模 提取重组子质粒 DNA，用BamHI，Bgl作双酶切鉴定验证，并作质粒 PCR 鉴 定。经双酶切和质粒 PCR 的实验结果初步确定的阳性重组子进行双向基因测序， 测序结果证明插入目的片段正确，证实新型牛溶菌酶基
9、因已经克隆到真核表达 载体 VR1020(VR1020-Lys，命名为 VRL)上。将重组质粒 VRL 以 JetPEIlt;#39;TMgt; Cationic polymer 分子包裹，介导转染 真核 HEK293 细胞，转染培养 24h、48h、72h 后分别提取培养细胞 mRNA 进行 RT-PCR，与 VR1020 转染细胞比较发现，转染后 24h、48h 和 72h 的 HEK293 细胞 的 RNA 中含有与目的 cDNA 片段对应的 mRNA。为了探索一种更经济高效的转染 介质，本实验同时还制备了壳聚糖纳米颗粒(chitosan nanoparticles，CNP)， 用此壳聚
10、糖纳米颗粒包裹重组质粒 VRL 后转染 HEK293 细胞，转染的 HEK293 细 胞中也表达与目的 cDNA 片段对应的 mRNA，说明了壳聚糖纳米颗粒也能作为一 种有效的转染介质。用转染后 HEK293 细胞上清分别作抑制标准大肠杆菌、产毒 性大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎球菌生长实验，实验结果证明 新构建的真核表达质粒 VRL 具有良好的抑制革兰氏阳性菌生长的效果，这些为 深入开展 VRL 在动物体内的抗感染抑菌实验奠定了可靠的基础。 溶菌酶(lysozyme，LYZ)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解细菌细胞壁中粘 多糖 -1，4-糖苷键的胞壁质酶，是一种碱性蛋白质，存在于
11、许多动物、植物 和微生物中。研究发现，溶菌酶对革兰氏阳性细菌具有直接的溶解作用，催化 革兰氏阳性菌细胞壁不溶性多糖水解，生成可溶性黏肽。在分泌型免疫球蛋白 A 和补体的参与下，溶菌酶还对革兰氏阴性细菌具有间接的溶解作用，是一种 天然的抗菌物质。由于其能够增强巨噬细胞和白细胞的吞噬和消化功能、将诱 发炎症的酸性物质灭活、增强抗菌素及其它药物的疗效，具有消炎消肿、帮助组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等药理作用，因此溶菌酶在医疗 界中倍受关注。近年来，随着生物学技术和免疫学技术的发展，对溶菌酶的研 究取得了令人瞩目的成就。利用 DNA 重组技术发展溶菌酶的抗菌效果，已成为 其中重要的研究方向
12、。 牛体内溶菌酶(bovine lysozyme，bLys)有大约 10 种， 表达的潜在位点有：乳腺、唾液、泪液、胃、气管组织以及中性粒细胞、嗜红 细胞、巨噬细胞、白细胞等。由于牛奶与人们的生活息息相关，其质量的好坏 关系着人们的健康，因此，对牛奶溶菌酶的研究尤为突出。为构建具有高效抗 菌、活性持久的抗菌基因，探索研制新型抗菌制剂，克服耐药性细菌感染日益 严重的问题，本实验构建了原核表达载体 pGEX-4T-1-Lys(pGL)。本实验是以成 功构建的新型牛溶菌酶基因原核表达载体 pGL 为模板，用 PCR 扩增得到目的片 段 Lys 基因，将 VR1020 和目的片段 Lys 分别用 Ba
13、mHI 和 Bgl双酶切，并将 VR1020 酶切片段先进行去磷酸化，然后将两种酶切产物在 16水浴过夜连接； 连接产物转化大肠杆菌 DH5a 感受态细胞，筛选重组子，用碱裂解法小规模提取 重组子质粒 DNA，用BamHI，Bgl作双酶切鉴定验证，并作质粒 PCR 鉴定。 经双酶切和质粒 PCR 的实验结果初步确定的阳性重组子进行双向基因测序，测 序结果证明插入目的片段正确，证实新型牛溶菌酶基因已经克隆到真核表达载 体 VR1020(VR1020-Lys，命名为 VRL)上。将重组质粒 VRL 以 JetPEIlt;#39;TMgt; Cationic polymer 分子包裹，介导转染 真核
14、 HEK293 细胞，转染培养 24h、48h、72h 后分别提取培养细胞 mRNA 进行 RT-PCR，与 VR1020 转染细胞比较发现，转染后 24h、48h 和 72h 的 HEK293 细胞 的 RNA 中含有与目的 cDNA 片段对应的 mRNA。为了探索一种更经济高效的转染 介质，本实验同时还制备了壳聚糖纳米颗粒(chitosan nanoparticles，CNP)， 用此壳聚糖纳米颗粒包裹重组质粒 VRL 后转染 HEK293 细胞，转染的 HEK293 细 胞中也表达与目的 cDNA 片段对应的 mRNA，说明了壳聚糖纳米颗粒也能作为一 种有效的转染介质。用转染后 HEK2
15、93 细胞上清分别作抑制标准大肠杆菌、产毒 性大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎球菌生长实验，实验结果证明 新构建的真核表达质粒 VRL 具有良好的抑制革兰氏阳性菌生长的效果，这些为 深入开展 VRL 在动物体内的抗感染抑菌实验奠定了可靠的基础。 溶菌酶(lysozyme，LYZ)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解细菌细胞壁中粘 多糖 -1，4-糖苷键的胞壁质酶，是一种碱性蛋白质，存在于许多动物、植物 和微生物中。研究发现，溶菌酶对革兰氏阳性细菌具有直接的溶解作用，催化 革兰氏阳性菌细胞壁不溶性多糖水解，生成可溶性黏肽。在分泌型免疫球蛋白 A 和补体的参与下，溶菌酶还对革兰氏阴性细菌具有
16、间接的溶解作用，是一种 天然的抗菌物质。由于其能够增强巨噬细胞和白细胞的吞噬和消化功能、将诱 发炎症的酸性物质灭活、增强抗菌素及其它药物的疗效，具有消炎消肿、帮助 组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等药理作用，因此溶菌酶在医疗 界中倍受关注。近年来，随着生物学技术和免疫学技术的发展，对溶菌酶的研 究取得了令人瞩目的成就。利用 DNA 重组技术发展溶菌酶的抗菌效果，已成为 其中重要的研究方向。 牛体内溶菌酶(bovine lysozyme，bLys)有大约 10 种， 表达的潜在位点有：乳腺、唾液、泪液、胃、气管组织以及中性粒细胞、嗜红 细胞、巨噬细胞、白细胞等。由于牛奶与人们的生活息息相关，其质量的好坏 关系着人们的健康，因此，对牛奶溶菌酶的研究尤为突出。为构建具有高效抗 菌、活性持久的抗菌基因，探索研制新型抗菌制剂，克服耐药性细菌感染日益 严重的问题，本实验构建了原核表达载体 pGEX-4T-1-Lys(pGL)。本实验是以成功构建的新型牛溶菌酶基因原核表达载体 pGL 为模板，用 PCR 扩增得到目的片 段 Lys
