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1、外科学外科学( (普通外科普通外科) )专业优秀论文专业优秀论文 整合素整合素 66 在结肠癌细胞生在结肠癌细胞生存和侵袭中的作用及相关分子机制研究存和侵袭中的作用及相关分子机制研究关键词：结肠癌关键词：结肠癌 整合素整合素 细胞生存细胞生存 细胞侵袭细胞侵袭 分子机制分子机制摘要：研究背景： 整合素属于粘附分子家族，是一类阳离子依赖的跨膜糖蛋 白受体，由 、 亚单位以非共价键结合组成。整合素介导细胞与细胞外基质， 以及细胞与细胞之间的相互作用，通过细胞外基质信号传导促进细胞的粘附、 增殖、转移和分化。 整合素 v6 是由 、 亚单位以非共价键结合组 成的跨膜异二聚体，是一类只表达于恶性上皮性
2、肿瘤组织而在正常组织及良性 组织无表达的特殊整合素亚型，目前研究发现 v6 在多种肿瘤的发生发展、 侵袭转移过程中发挥重要作用，对其研究已成为热点，并可为恶性肿瘤的诊治 提供广阔的应用前景。 在胚胎发育过程中以及上皮源性肿瘤及多种肿瘤细胞 系，可见整合素 v6 高表达。在成年组织炎症和损伤修复过程中， v6 可促进上皮细胞增殖、迁移至损伤部位，帮助上皮的重建。在腺上皮来源消化 道肿瘤中的表达强度以胰腺癌最高，其次为胃癌、结直肠癌、胆管癌、肝癌： 鳞状上皮来源肿瘤如肺癌、口腔鳞状上皮癌亦可见其表达。 我们课题组对 v6 与结肠癌之间的关系进行了系统深入的研究：发现不同类型结肠癌细 胞表面具有不同
3、数量的 v6 表达，且与肿瘤恶性程度密切相关；利用 v6-cDNA 表达质粒转染结肠癌细胞系 SW480，在体内外研究中发现，转染后细 胞的增殖能力显著提高，动物实验中成瘤率、瘤体质量、体积等较未转染组均 有显著增加，并且通过 6 胞内结构域不同部位删除后转染技术证实 6 独有 的 C 末端 11 个氨基酸是控制其恶性行为的关键部位；我们对 v6 与信号通 路之间的关系进行深入研究，通过免疫共沉淀、免疫印迹技术发现 v6 与 ERK 之间存在直接连接；肿瘤细胞通过 v6-MAPK/ERK 信号通路调控 MMP-9 分泌，随着整合素 v6 的表达增多 MAPK 活性增加并伴随 MMP-9 分泌增
4、多， 加速破坏降解细胞外基质促进肿瘤细胞的侵袭转移，通过基因转染技术删除 6 胞内段 ERK 结合位点（746EAERSKAKWQTGTNPLYRG764，下划线表示两者结合 位点）可以显著抑制肿瘤细胞的生长；我们的研究亦发现，在结肠癌细胞中 v6 可促进细胞增殖，随着肿瘤细胞密度增加伴有 PKC 活性增强，细胞可通过 PKC 途径调控新生更多的 v6， v6 可通过 PKC 途径诱导 MMP-9 的分泌 增多，降解胞外基质加速细胞扩增，如此交叉循环促进肿瘤的生长；我们利用 反义寡核苷酸技术沉默 v6 在结肠癌细胞系 HT29 和 Widr 的表达，显著抑 制 MAPK 活性，以及伴有细胞增殖
5、侵袭能力的降低，在动物实验中可达到抑制肿 瘤生长的目的。 在最近组织学的研究中，Richard C.Bates 等发现，在结肠 癌细胞上皮间质转化（EMT）模型中可诱导 v6 表达，组织芯片-免疫组织 化学证实 488 例结肠癌组织中阳性表达率为 37，在淋巴结及肝癌转移标本中 均检测到 v6 的表达， v6 与中位生存时间密切相关，可作为结肠癌 预后指标。我们利用组织芯片-免疫组织化学技术检测 300 例胃癌组织标本 v6 的表达并分析其与临床病理特征及预后的关系，发现其阳性表达率为 36.7，并且与肿瘤病理类型、分化程度、淋巴结转移、TNM 分期密切相关， Kaplan-Meier 曲线分
6、析 v6 阳性表达患者生存期限明显缩短，可作为胃癌 的独立预后指标。我们最近的研究发现检测 358 例原发结肠癌组织 v6 阳性表达率（34.0）明显低于 63 例结肠癌肝转移组织的表达率（71.4） ，提 示 v6 阳性表达患者较阴性表达着更具有肝脏转移能力，该研究为结肠癌 肝转移提供了新的理论支持，提示 v6 在结肠癌侵袭转移过程中起了重要 作用。 综上所述， v6 作为一种重要的细胞粘附分子受体，在胃肠道恶 性肿瘤的侵袭转移过程中发挥重要作用，其具体的作用机制目前已成为研究热 点。本研究是在既往国内外研究的基础上，进一步探讨 v6 在结肠癌细胞 生长侵袭中的作用及相关的分子机制，随着研究
7、的不断深入，必将为特异性靶 向抗肿瘤药物的研制开发和恶性肿瘤的生物治疗提供广阔的应用前景。 第一 部分：整合素 v6 通过 MAPK 信号通路调控结肠癌细胞侵袭转移和胞外基质 降解 研究目的： 探讨整合素 v6 在结肠癌细胞侵袭转移中的作用及 调控胞外基质（ECM）降解的相关分子机制。 研究方法： 1.利用 pSIREN- DNR-DsRed-Express Vector 质粒构建 v6 特异性 shRNA 表达载体和对照组 表达载体。 v6 特异性 shRNA 表达载体以脂质体法转染人结肠癌细胞系 HT2972 小时，用 RT-PCR，yestern blotting 实验分别检测 v6 m
8、RNA 和蛋 白的表达水平； 2.细胞侵袭实验检测 RNAi 介导 v6 基因沉默对结肠癌 细胞 HT29 体外侵袭能力的影响； 3.Western blot 实验检测 RNAi 介导 v6 基因沉默对结肠癌细胞 ERK1/2，phospho-ERK1/2（P-ERK）表达的影响； 4.Western blot 实验检测 RNAi 介导 v6 基因沉默对结肠癌细胞 uPA 表达 的影响； 5.明胶酶谱法检测 RNAi 介导 v6 基因沉默对结肠癌细胞 MMP- 2，MMP-9 表达的影响； 6.3H标记的型胶原降解分析实验检测 RNAi 介导 v6 基因沉默对结肠癌细胞胞外基质降解能力的影响以
9、及 MAPK 信号通路与 uPA、MMP-2、MMP-9 在胞外基质降解中的作用。 结果： 1.特异性 shRNA 表达载体可有效抑制 HT29 细胞中 v6 的 mRNA 和蛋白表达； 2.RNA 干扰 介导抑制 v6 表达显著抑制 HT29 细胞的体外侵袭能力； 3.RNAi 介导 v6 基因沉默显著抑制结肠癌细胞 ERK1/2 的表达，更重要的是抑制了其活性 形式即磷酸化 ERK1/2（phospho-ERK1/2，P-ERK）的表达； 4.RNAi 介导 v6 基因沉默显著抑制结肠癌细胞 uPA，pro-MMP-9 和 pro-MMP-2 的分泌； 5.RNAi 介导 v6 基因沉默可
10、显著抑制胞外基质的降解，且 v6 介导的 胞外基质降解是通过 MAPK 信号通路调控 uPA、MMP-2、MMP-9 分泌实现的。 结论： 整合素 v6 特异性 shRNA 表达载体，可有效抑制结肠癌细胞 v6 的表达；沉默 v6 表达可显著抑制 uPA、MMP-9、MMP-2 以及 ERK1/2 介导的胞外基质降解； v6 通过 MAPK 信号通路调控 uPA、MMP-9 和 MMP-2 的分泌及活性，从而调控细胞外基质的降解，在结肠癌侵袭转移中发挥了重要 作用（见示意图） 。 意义： 本实验研究结果进一步揭示出 v6 在结肠 癌细胞侵袭转移中的作用及相关分子机制；进一步从细胞及分子水平上解
11、释了 前期组织学研究成果如 v6 可作为胃、结肠癌的独立预后指标，结肠癌 v6 阳性表达患者较阴性表达着具有更强肝脏转移能力；成功设计出 v6 RNA 干扰序列及表达载体，为以 v6 为靶点的结肠癌基因治疗提供理论依 据。正文内容正文内容研究背景： 整合素属于粘附分子家族，是一类阳离子依赖的跨膜糖蛋白 受体，由 、 亚单位以非共价键结合组成。整合素介导细胞与细胞外基质， 以及细胞与细胞之间的相互作用，通过细胞外基质信号传导促进细胞的粘附、 增殖、转移和分化。 整合素 v6 是由 、 亚单位以非共价键结合组 成的跨膜异二聚体，是一类只表达于恶性上皮性肿瘤组织而在正常组织及良性 组织无表达的特殊整
12、合素亚型，目前研究发现 v6 在多种肿瘤的发生发展、 侵袭转移过程中发挥重要作用，对其研究已成为热点，并可为恶性肿瘤的诊治 提供广阔的应用前景。 在胚胎发育过程中以及上皮源性肿瘤及多种肿瘤细胞 系，可见整合素 v6 高表达。在成年组织炎症和损伤修复过程中， v6 可促进上皮细胞增殖、迁移至损伤部位，帮助上皮的重建。在腺上皮来源消化 道肿瘤中的表达强度以胰腺癌最高，其次为胃癌、结直肠癌、胆管癌、肝癌： 鳞状上皮来源肿瘤如肺癌、口腔鳞状上皮癌亦可见其表达。 我们课题组对 v6 与结肠癌之间的关系进行了系统深入的研究：发现不同类型结肠癌细 胞表面具有不同数量的 v6 表达，且与肿瘤恶性程度密切相关；
13、利用 v6-cDNA 表达质粒转染结肠癌细胞系 SW480，在体内外研究中发现，转染后细 胞的增殖能力显著提高，动物实验中成瘤率、瘤体质量、体积等较未转染组均 有显著增加，并且通过 6 胞内结构域不同部位删除后转染技术证实 6 独有 的 C 末端 11 个氨基酸是控制其恶性行为的关键部位；我们对 v6 与信号通 路之间的关系进行深入研究，通过免疫共沉淀、免疫印迹技术发现 v6 与 ERK 之间存在直接连接；肿瘤细胞通过 v6-MAPK/ERK 信号通路调控 MMP-9 分泌，随着整合素 v6 的表达增多 MAPK 活性增加并伴随 MMP-9 分泌增多， 加速破坏降解细胞外基质促进肿瘤细胞的侵袭
14、转移，通过基因转染技术删除 6 胞内段 ERK 结合位点（746EAERSKAKWQTGTNPLYRG764，下划线表示两者结合 位点）可以显著抑制肿瘤细胞的生长；我们的研究亦发现，在结肠癌细胞中 v6 可促进细胞增殖，随着肿瘤细胞密度增加伴有 PKC 活性增强，细胞可通过 PKC 途径调控新生更多的 v6， v6 可通过 PKC 途径诱导 MMP-9 的分泌 增多，降解胞外基质加速细胞扩增，如此交叉循环促进肿瘤的生长；我们利用 反义寡核苷酸技术沉默 v6 在结肠癌细胞系 HT29 和 Widr 的表达，显著抑 制 MAPK 活性，以及伴有细胞增殖侵袭能力的降低，在动物实验中可达到抑制肿 瘤生
15、长的目的。 在最近组织学的研究中，Richard C.Bates 等发现，在结肠 癌细胞上皮间质转化（EMT）模型中可诱导 v6 表达，组织芯片-免疫组织 化学证实 488 例结肠癌组织中阳性表达率为 37，在淋巴结及肝癌转移标本中 均检测到 v6 的表达， v6 与中位生存时间密切相关，可作为结肠癌 预后指标。我们利用组织芯片-免疫组织化学技术检测 300 例胃癌组织标本 v6 的表达并分析其与临床病理特征及预后的关系，发现其阳性表达率为 36.7，并且与肿瘤病理类型、分化程度、淋巴结转移、TNM 分期密切相关， Kaplan-Meier 曲线分析 v6 阳性表达患者生存期限明显缩短，可作为胃癌 的独立预后指标。我们最近的研究发现检测 358 例原发结肠癌组织 v6 阳 性表达率（34.0）明显低于 63 例结肠癌肝转移组织的表达率（71.4） ，提 示 v6 阳性表达患者较阴性表达着更具有肝脏转移能力，该研究为结肠癌 肝转移提供了新的理论支持，提示 v6 在结肠癌侵袭转移过程中起了重要 作用。 综上所述， v6 作为一种重要
