《应用生物反应器及体外微团培养构建骨软骨复合体修复关节软骨损伤的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《应用生物反应器及体外微团培养构建骨软骨复合体修复关节软骨损伤的实验研究（38页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、外科学外科学( (骨外骨外) )专业优秀论文专业优秀论文 应用生物反应器及体外微团培养构建应用生物反应器及体外微团培养构建骨软骨复合体修复关节软骨损伤的实验研究骨软骨复合体修复关节软骨损伤的实验研究关键词：骨软骨缺损关键词：骨软骨缺损 骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞 微团培养微团培养 -磷酸三钙磷酸三钙 生物反应器生物反应器 骨软骨复合体骨软骨复合体 陶瓷支架材料陶瓷支架材料摘要：目的： 关节软骨主要是由软骨细胞及其周围的外基质组成的无血管组 织。关节软骨损伤是骨科的较为常见的疾患，其损伤后自我修复能力很弱，至 今软骨缺损的修复仍无理想的方法。创伤、骨软骨炎、骨性关节炎、髌骨软化 等均可引起
2、软骨以及软骨下骨的损伤和（或）缺损。软骨损伤的修复一直是骨 关节外科的一个难题，目前对于轻度的软骨损伤主要以保守疗法为主，而晚期 严重的软骨损伤可引起严重的膝关节疼痛，畸形等，通常采用人工关节置换术 为主。本课题采用组织工程技术，体外分离骨髓间充质干细胞（bMSCs） ，用微 团培养方法经过特定生长因子诱导生成软骨细胞和成骨细胞后，将软骨细胞、 成骨细胞种植于三维多孔 磷酸三钙（TCP）生物陶瓷支架材料上置于 生物反应器中复合培养，构建骨软骨复合体，观察细胞在支架材料上的黏附、 伸展和增殖情况，并模仿马赛克骨软骨移植术用塑型良好的骨软骨复合体修复 动物软骨缺损，观察其修复情况，探讨以 TCP
3、为载体建造组织工程化软骨 修复骨软骨缺损的可行性。 材料和方法： 1.取 410 月龄健康比格犬 3 只，无菌穿刺抽取髂骨骨髓 67ml，Percoll 分离法分离骨髓间充质干细胞， 进行原代、传代细胞培养。流式细胞仪鉴定。取第 3 代的 bMSCs，根据滴加生 长因子的不同，分为三组：组软骨细胞诱导组，滴加软骨细胞诱导液（组成： BMP2200ngml，IGF10ngml，转铁蛋白 625ug/ml，地塞米松 10 7M/L，维生素 C50ug/ml） ；组成骨细胞诱导组，滴加成骨细胞诱导液（组成： 地塞米松 100nmolL，甘油磷酸钠 10mmol/L，维生素 C005mmolL） ；
4、组空白对照组，未滴加任何诱导因子。三组中常规加入含 10%胎牛血清的 H DMEM 液，采用体外微团培养。倒置相差显微镜观察细胞生长状况，诱导培养 14 天后，软骨细胞诱导组行 MTT 法观察细胞增殖状况，细胞培养上清液检测糖胺 聚糖的含量，免疫细胞化学检测诱导细胞型胶原的分泌，以观察 bMSCs 向软 骨细胞分化的情况；成骨细胞诱导组行碱性磷酸酶染色和矿化结节染色以观察 bMSCs 向成骨细胞分化的情况。 2.取经过诱导培养 14 天的 bMSCs，经检验诱 导成软骨细胞和成骨细胞后，分别调整细胞浓度为 5106/ml，与 磷酸三 钙（TCP）复合培养 1 天，置入生物反应器中培养 21 天
5、，进行复合组织的 病理形态学观察；动物实验备用。磷酸三钙（TCP）及软骨细胞成骨 细胞磷酸三钙支架复合体进行扫描电镜观察。以观察 TCP 支架材料 的结构、孔隙率；观察软骨细胞、成骨细胞在 磷酸三钙支架内黏附和生长 增殖情况。 3.取 1012 月龄健康比格犬 9 只，在实验犬的股骨滑车处钻直 径 45mm，深度 45mm 的骨软骨缺损，深达软骨下区。随机分为 3 组：A 组， 作为实验组，9 只，左膝软骨缺损处深层植入软骨细胞成骨细胞磷酸 三钙复合体；B 组，作为阴性对照组，9 只，左膝软骨缺损处植入软骨细胞 磷酸三钙复合体；C 组，空白对照组，9 只，左膝软骨缺损处植入空白 磷酸三钙。分别
6、于术后 12、16 周处死取材，进行大体和组织学观察。 结果: 1.细胞形态学改变倒置相差显微镜观察发现，原代细胞接种后 13 日可见少量细胞贴壁，呈短梭形。3 日后可见细胞集落形成，78 日广泛集落形成。12 14 日细胞形成单层。传代细胞贴壁快，78 日形成单层，细胞核大，胞浆内颗 粒多。取 P3 代细胞进行微团诱导培养，加入细胞因子后，细胞生长加快，微团 中央形成细胞团块，边缘呈漩涡状生长。 2.加入细胞因子 BMP2（组） 的 MTT 吸光度值、培养上清液中的糖胺聚糖（GAG）含量和型胶原分泌均明显 高于对照组（组） 。型胶原免疫细胞化学阳性的 bMSCs 胞浆染色为黄色或棕 黄色。碱
7、性磷酸酶（ALP）染色显示成骨细胞胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或 块状沉淀；矿化结节染色表明成骨细胞可形成肉眼可见的白色矿化结节，常用 茜素红法染色，染料品种的不同，矿化结节呈显不同的红色。 3.电镜观察： 扫描电镜显示 磷酸三钙（TCP）材料平均孔径为 400600m，孔隙率 为 75%10%，气孔沟通率达 100%。复合材料显示软骨细胞、成骨细胞在 磷酸三钙（TCP）支架上的黏附、伸展和增殖良好，可以见到细胞分泌的基 质和细胞伪足的铆固作用，表明支架材料具有良好的细胞亲和性。 4.动物实 验结果 大体观察：术后 16 周，实验组缺损修复区组织与周围关节软骨相整 合，软骨缺损区被光滑白色半透
8、明的组织覆盖，与周围软骨组织外形无差异； 阴性对照组缺损区修复组织与周围软骨部分整合在一起，光泽较差；空白对照 组缺损处修复组织低凹，新生组织软，无光泽，与周围软骨组织区别明显。组 织学观察：术后 16 周，实验组缺损区软骨厚度与正常软骨组织接近，细胞排列 出现明显规律，表面层的软骨细胞平行关节面排列，深层纵向排列，与透明软 骨组织相似，软骨下骨形成，潮线基本恢复，与周围正常软骨连接较好。阴性 对照组软骨细胞排列不规则，中央修复区大部分为纤维组织修复。空白对照组 缺损区内主要为纤维组织。 结论： 1. bMSCs 为软骨组织工程理想的种子 细胞。取材方便，Percoll 分离法分离可以获取大量
9、骨髓间充质干细胞，体外 培养能够保持其表形的稳定性，易于传代扩增，在一定诱导条件的培养下，可 以分化为软骨细胞和成骨细胞。 2. BMP2 在促进 bMSCs 细胞增殖和向软骨 细胞定向分化方面有显著的作用，均明显高于对照组，是目前诱导 bMSCs 向软 骨细胞方向分化的理想细胞因子。 3.三维培养方法是目前诱导 bMSCs 向软骨 方向分化的最理想的培养方法。 4. 磷酸三钙（TCP）支架是理想的 软骨组织工程支架材料。具有良好的孔隙率和组织相容性，软骨细胞和成骨细 胞在其中可以很好地黏附、扩展和增殖。 5. bMSCs 经向软骨细胞、成骨细 胞定向分化后复合 磷酸三钙（TCP）支架材料，在
10、体外构建骨软骨复 合体，可以有效修复骨软骨缺损。动物实验表明，该复合体修复的软骨缺损明 显优于软骨细胞磷酸三钙复合体修复的软骨缺损，与正常软骨组织形态 接近。 6. 灌注型生物反应器使软骨和成骨细胞在三维载体内存活并增殖， 提高细胞在载体内的复合效率。正文内容正文内容目的： 关节软骨主要是由软骨细胞及其周围的外基质组成的无血管组织。 关节软骨损伤是骨科的较为常见的疾患，其损伤后自我修复能力很弱，至今软 骨缺损的修复仍无理想的方法。创伤、骨软骨炎、骨性关节炎、髌骨软化等均 可引起软骨以及软骨下骨的损伤和（或）缺损。软骨损伤的修复一直是骨关节 外科的一个难题，目前对于轻度的软骨损伤主要以保守疗法为
11、主，而晚期严重 的软骨损伤可引起严重的膝关节疼痛，畸形等，通常采用人工关节置换术为主。 本课题采用组织工程技术，体外分离骨髓间充质干细胞（bMSCs） ，用微团培养 方法经过特定生长因子诱导生成软骨细胞和成骨细胞后，将软骨细胞、成骨细 胞种植于三维多孔 磷酸三钙（TCP）生物陶瓷支架材料上置于生物反 应器中复合培养，构建骨软骨复合体，观察细胞在支架材料上的黏附、伸展和 增殖情况，并模仿马赛克骨软骨移植术用塑型良好的骨软骨复合体修复动物软 骨缺损，观察其修复情况，探讨以 TCP 为载体建造组织工程化软骨修复骨 软骨缺损的可行性。 材料和方法： 1.取 410 月龄健康比格犬 3 只，无 菌穿刺抽
12、取髂骨骨髓 67ml，Percoll 分离法分离骨髓间充质干细胞，进行原 代、传代细胞培养。流式细胞仪鉴定。取第 3 代的 bMSCs，根据滴加生长因子 的不同，分为三组：组软骨细胞诱导组，滴加软骨细胞诱导液（组成：BMP 2200ngml，IGF10ngml，转铁蛋白 625ug/ml，地塞米松 107M/L， 维生素 C50ug/ml） ；组成骨细胞诱导组，滴加成骨细胞诱导液（组成：地塞 米松 100nmolL，甘油磷酸钠 10mmol/L，维生素 C005mmolL） ；组 空白对照组，未滴加任何诱导因子。三组中常规加入含 10%胎牛血清的 HDMEM 液，采用体外微团培养。倒置相差显微
13、镜观察细胞生长状况，诱导培养 14 天后， 软骨细胞诱导组行 MTT 法观察细胞增殖状况，细胞培养上清液检测糖胺聚糖的 含量，免疫细胞化学检测诱导细胞型胶原的分泌，以观察 bMSCs 向软骨细胞 分化的情况；成骨细胞诱导组行碱性磷酸酶染色和矿化结节染色以观察 bMSCs 向成骨细胞分化的情况。 2.取经过诱导培养 14 天的 bMSCs，经检验诱导成 软骨细胞和成骨细胞后，分别调整细胞浓度为 5106/ml，与 磷酸三钙 （TCP）复合培养 1 天，置入生物反应器中培养 21 天，进行复合组织的病 理形态学观察；动物实验备用。磷酸三钙（TCP）及软骨细胞成骨细 胞磷酸三钙支架复合体进行扫描电镜
14、观察。以观察 TCP 支架材料的 结构、孔隙率；观察软骨细胞、成骨细胞在 磷酸三钙支架内黏附和生长增 殖情况。 3.取 1012 月龄健康比格犬 9 只，在实验犬的股骨滑车处钻直径 45mm，深度 45mm 的骨软骨缺损，深达软骨下区。随机分为 3 组：A 组，作 为实验组，9 只，左膝软骨缺损处深层植入软骨细胞成骨细胞磷酸三 钙复合体；B 组，作为阴性对照组，9 只，左膝软骨缺损处植入软骨细胞 磷酸三钙复合体；C 组，空白对照组，9 只，左膝软骨缺损处植入空白 磷 酸三钙。分别于术后 12、16 周处死取材，进行大体和组织学观察。 结果: 1.细胞形态学改变倒置相差显微镜观察发现，原代细胞接
15、种后 13 日可见少量 细胞贴壁，呈短梭形。3 日后可见细胞集落形成，78 日广泛集落形成。12 14 日细胞形成单层。传代细胞贴壁快，78 日形成单层，细胞核大，胞浆内颗 粒多。取 P3 代细胞进行微团诱导培养，加入细胞因子后，细胞生长加快，微团 中央形成细胞团块，边缘呈漩涡状生长。 2.加入细胞因子 BMP2（组） 的 MTT 吸光度值、培养上清液中的糖胺聚糖（GAG）含量和型胶原分泌均明显高于对照组（组） 。型胶原免疫细胞化学阳性的 bMSCs 胞浆染色为黄色或棕 黄色。碱性磷酸酶（ALP）染色显示成骨细胞胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或 块状沉淀；矿化结节染色表明成骨细胞可形成肉眼可见的白色矿化结节，常用 茜素红法染色，染料品种的不同，矿化结节呈显不同的红色。 3.电镜观察： 扫描电镜显示 磷酸三钙（TCP）材料平均孔径为 400600m，孔隙率 为 75%10%，气孔沟通率达 100%。复合材料显示软骨细胞、成骨细胞在 磷酸三钙（TCP）支架上的黏附、伸展和增殖良好，可以见到细胞分泌的基 质和细胞伪足的铆固作用，表明支架材料具有良好的细胞亲和性。 4.动物实 验结果 大体观察：术后 16 周，实验组缺损修复区组织与周围关节软骨相整 合，软骨缺损区被光滑白色半透明的组织覆盖，与周围软骨组织外形无差异； 阴
