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1、微生物学专业优秀论文微生物学专业优秀论文 人人 CR1CR1 功能域功能域 SCR15-18SCR15-18 在毕赤酵母中的表在毕赤酵母中的表达及其对肠缺血再灌注损伤的保护作用达及其对肠缺血再灌注损伤的保护作用关键词：肠缺血再灌注损伤关键词：肠缺血再灌注损伤 补体受体补体受体 1 1 型短型短 同源重复序列同源重复序列 补体抑制因子补体抑制因子 毕毕 赤酵母赤酵母 蛋白表达蛋白表达摘要：肠缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury， I/R)是外科常见的 组织器官损伤之一，在严重感染、创伤、休克、心肺功能不全等疾患的病理演 变过程中起重要作用，死亡率高。肠 I/R
2、损伤是多种因素作用的结果，其发病 机制极其复杂。近年来的研究表明，补体系统过度活化在肠 I/R 损伤的发生与 展中起着十分重要的作用，抑制补体活化已成为防治肠缺血再灌注损伤的重要 策略。 在缺血再灌注损伤等补体过度活化的疾病中，坏死的组织细胞、MBL 复合物、暴露的抗原和线粒体等通过经典、旁路和 MBL 三个补体途径共同激活 补体。同时，补体活化产物 C3a、C5a 和 C5b-9 均参与了组织损伤过程，出现恶 性循环。因此，单一的从某一条途径或某一活化产物阻断补体介导的损伤是不 够的。在三条补体激活途径中，虽然活化起始点不同，但都在 C3 处汇合，通过 C3 转化酶裂解 C3，继而形成 C5
3、 转化酶，裂解 C5，活化补体形成攻膜复合物 (membrane attack complex，MAC)，因此 C3/C5 转化酶是理想的抑制靶点。补 体受体 1 型(complement receptor type1，CRl)是由 30 个短同源重复序列( short consensus repeats，SCR)构成的补体抑制因子，是体内唯一的既对经典、 旁路、MBL 三个补体激活途径的 C3/C5 转化酶有加速衰变作用，又有辅助 I 因 子裂解 C3b/C4b 作用的补体调节蛋白。其中 SCR15-18，能结合 C3b/C4b，阻碍 C3/C5 转化酶的形成，辅助 I 因子裂解 C3b/C
4、4b，进而抑制 C3/C5 转化酶，阻断 和抑制 C5a 及 C5b-9 等炎症介质的产生，具有抗补体治疗的潜在应用价值。 本研究在我室前期工作的基础上构建 CR1-SCR15-18 的毕赤酵母表达质粒，在毕 赤酵母中诱导分泌表达目的蛋白 CR1-SCR15-18，用 Ni2+-NTA 树脂亲和层析纯 化表达产物，并观察目的蛋白 CR1-SCR15-18 在体外抑制补体溶血的活性以及在 体内对急性肠 I/R 损伤的保护作用。研究取得了以下主要结果： 1.根据人 CR1-SCR15-18 DNA 序列和 pPIC9 的多克隆酶切位点分别设计一对引物，在上游 引物(Pl)通过 XholI 酶切位点
5、把目的片段连在信号肽序列的后面，下游引物(P2)加 入 TAG 终止密码、6X HIS 标签和 Not I 酶切位点。以 pET32a-sCR1-SCR15-18 重组质粒为模板，成功扩增了 CR1-SCR15-18 DNA 片段，片段大小为 756 bp。 2.将 PCR 扩增获得的目的基因片段和 pPIC9 质粒经 Xhol I+Not I 双酶切，胶回 收后，两者按一定比例用 T4 连接酶连接，构建重组质粒。重组质粒经酶切、 PCR 和测序鉴定正确，命名为 pPIC9-CR1-SCR15-18。 3.SalI 线性化 pPIC9- CR1-SCR15-18，胶回收后电转化毕赤酵母 GS1
6、15 感受态细胞，经组氨酸营养缺 陷型培养基(MD 平板)筛选重组酵母菌。经 PCR 鉴定确认，成功筛选到 4 个阳性 酵母转化子，命名为 pPIC9-CR1-SCR15-18/GS115。 4.阳性转化子菌落接种 BMGY 增菌，换 BMMY 后在摇瓶水平经甲醇诱导表达，表达产物经 SDS-PAGE 和 Westem blot 证实，目的基因在毕赤酵母中成功分泌表达。 5.CRl-SCR15-18 蛋白经 Ni2+-NTA 柱纯化后，基本无杂蛋白存在，表明采用亲和层析可实现 CR1-SCR15-18 蛋白的一步快速纯化。纯化干燥后称重，蛋白最终得率为 31.8mg/L，为高密度发酵奠定了基础
7、。 6.体外生物活性分析显示，目的蛋白具有抑制补体溶血的活性，随着蛋白浓度的降低，抑制补体溶血的能力随之减 弱，目的蛋白抑制补体溶血的活性有量效关系。表明我们制备的重组蛋白在体 外有抑制补体活性的功能。 7.成功建立大鼠急性肠 I/R 动物模型。体内实验 发现：I/R 组的结果与假手术组的相比，血管通透性增加，MPO 活性和 MDA 含量 显著升高，而 SOD 活性降低，肠组织原位有大量的补体 C3 组分沉积，病理损伤 严重，肠黏膜顶端上皮大片坏死，脱落，大量炎症细胞侵润、黏膜固有层水肿、 瘀血、细胞构成增多；与 I/R 组相比，CR1 保护组肠血管通透性显著降低，MPO 活性和 MDA 含量
8、显著降低，而 SOD 活性升高，肠粘膜组织原位仅有少量补体 C3 组分的沉积，病理损伤显著减轻。 综上所述：本实验成功构建了 CR1- SCR15-18 的毕赤酵母表达质粒，在毕赤酵母中分泌表达了 CR1-SCR15-18 蛋白， 并证实纯化后的 CR1-SCR15-18 蛋白在体外有抑制补体活性的功能，在体内对大 鼠急性肠 I/R 损伤有抗炎保护作用。为进一步研究补体介导的缺血再灌注损伤、 异种器官移植超急性排斥反应等疾病的防治奠定了基础。正文内容正文内容肠缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury， I/R)是外科常见的组 织器官损伤之一，在严重感染、创伤、休克
9、、心肺功能不全等疾患的病理演变 过程中起重要作用，死亡率高。肠 I/R 损伤是多种因素作用的结果，其发病机 制极其复杂。近年来的研究表明，补体系统过度活化在肠 I/R 损伤的发生与展 中起着十分重要的作用，抑制补体活化已成为防治肠缺血再灌注损伤的重要策 略。 在缺血再灌注损伤等补体过度活化的疾病中，坏死的组织细胞、MBL 复 合物、暴露的抗原和线粒体等通过经典、旁路和 MBL 三个补体途径共同激活补 体。同时，补体活化产物 C3a、C5a 和 C5b-9 均参与了组织损伤过程，出现恶性 循环。因此，单一的从某一条途径或某一活化产物阻断补体介导的损伤是不够 的。在三条补体激活途径中，虽然活化起始
10、点不同，但都在 C3 处汇合，通过 C3 转化酶裂解 C3，继而形成 C5 转化酶，裂解 C5，活化补体形成攻膜复合物 (membrane attack complex，MAC)，因此 C3/C5 转化酶是理想的抑制靶点。补 体受体 1 型(complement receptor type1，CRl)是由 30 个短同源重复序列( short consensus repeats，SCR)构成的补体抑制因子，是体内唯一的既对经典、 旁路、MBL 三个补体激活途径的 C3/C5 转化酶有加速衰变作用，又有辅助 I 因 子裂解 C3b/C4b 作用的补体调节蛋白。其中 SCR15-18，能结合 C3
11、b/C4b，阻碍 C3/C5 转化酶的形成，辅助 I 因子裂解 C3b/C4b，进而抑制 C3/C5 转化酶，阻断 和抑制 C5a 及 C5b-9 等炎症介质的产生，具有抗补体治疗的潜在应用价值。 本研究在我室前期工作的基础上构建 CR1-SCR15-18 的毕赤酵母表达质粒，在毕 赤酵母中诱导分泌表达目的蛋白 CR1-SCR15-18，用 Ni2+-NTA 树脂亲和层析纯 化表达产物，并观察目的蛋白 CR1-SCR15-18 在体外抑制补体溶血的活性以及在 体内对急性肠 I/R 损伤的保护作用。研究取得了以下主要结果： 1.根据人 CR1-SCR15-18 DNA 序列和 pPIC9 的多克
12、隆酶切位点分别设计一对引物，在上游 引物(Pl)通过 XholI 酶切位点把目的片段连在信号肽序列的后面，下游引物(P2)加 入 TAG 终止密码、6X HIS 标签和 Not I 酶切位点。以 pET32a-sCR1-SCR15-18 重组质粒为模板，成功扩增了 CR1-SCR15-18 DNA 片段，片段大小为 756 bp。 2.将 PCR 扩增获得的目的基因片段和 pPIC9 质粒经 Xhol I+Not I 双酶切，胶回 收后，两者按一定比例用 T4 连接酶连接，构建重组质粒。重组质粒经酶切、 PCR 和测序鉴定正确，命名为 pPIC9-CR1-SCR15-18。 3.SalI 线性
13、化 pPIC9- CR1-SCR15-18，胶回收后电转化毕赤酵母 GS115 感受态细胞，经组氨酸营养缺 陷型培养基(MD 平板)筛选重组酵母菌。经 PCR 鉴定确认，成功筛选到 4 个阳性 酵母转化子，命名为 pPIC9-CR1-SCR15-18/GS115。 4.阳性转化子菌落接种 BMGY 增菌，换 BMMY 后在摇瓶水平经甲醇诱导表达，表达产物经 SDS-PAGE 和 Westem blot 证实，目的基因在毕赤酵母中成功分泌表达。 5.CRl-SCR15-18 蛋白经 Ni2+-NTA 柱纯化后，基本无杂蛋白存在，表明采用亲和层析可实现 CR1-SCR15-18 蛋白的一步快速纯化
14、。纯化干燥后称重，蛋白最终得率为 31.8mg/L，为高密度发酵奠定了基础。 6.体外生物活性分析显示，目的蛋白 具有抑制补体溶血的活性，随着蛋白浓度的降低，抑制补体溶血的能力随之减 弱，目的蛋白抑制补体溶血的活性有量效关系。表明我们制备的重组蛋白在体 外有抑制补体活性的功能。 7.成功建立大鼠急性肠 I/R 动物模型。体内实验 发现：I/R 组的结果与假手术组的相比，血管通透性增加，MPO 活性和 MDA 含量 显著升高，而 SOD 活性降低，肠组织原位有大量的补体 C3 组分沉积，病理损伤严重，肠黏膜顶端上皮大片坏死，脱落，大量炎症细胞侵润、黏膜固有层水肿、 瘀血、细胞构成增多；与 I/R
15、 组相比，CR1 保护组肠血管通透性显著降低，MPO 活性和 MDA 含量显著降低，而 SOD 活性升高，肠粘膜组织原位仅有少量补体 C3 组分的沉积，病理损伤显著减轻。 综上所述：本实验成功构建了 CR1- SCR15-18 的毕赤酵母表达质粒，在毕赤酵母中分泌表达了 CR1-SCR15-18 蛋白， 并证实纯化后的 CR1-SCR15-18 蛋白在体外有抑制补体活性的功能，在体内对大 鼠急性肠 I/R 损伤有抗炎保护作用。为进一步研究补体介导的缺血再灌注损伤、 异种器官移植超急性排斥反应等疾病的防治奠定了基础。 肠缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury， I
16、/R)是外科常见的组织器 官损伤之一，在严重感染、创伤、休克、心肺功能不全等疾患的病理演变过程 中起重要作用，死亡率高。肠 I/R 损伤是多种因素作用的结果，其发病机制极 其复杂。近年来的研究表明，补体系统过度活化在肠 I/R 损伤的发生与展中起 着十分重要的作用，抑制补体活化已成为防治肠缺血再灌注损伤的重要策略。 在缺血再灌注损伤等补体过度活化的疾病中，坏死的组织细胞、MBL 复合物、 暴露的抗原和线粒体等通过经典、旁路和 MBL 三个补体途径共同激活补体。同 时，补体活化产物 C3a、C5a 和 C5b-9 均参与了组织损伤过程，出现恶性循环。 因此，单一的从某一条途径或某一活化产物阻断补体介导的损伤是不够的。在 三条补体激活途径中，虽然活化起始点不同，但都在 C3 处汇合，通过 C3 转化 酶裂解 C3，继而形成 C5 转化酶，裂解 C5，活化补体形成攻膜复合物(membrane attack complex，MAC)，因此 C3/C5 转化酶是理想的抑制靶点。补体
