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1、老年医学专业毕业论文老年医学专业毕业论文 精品论文精品论文 PPARPPAR 激动剂吡格列酮对大激动剂吡格列酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的机制研究鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的机制研究关键词：关键词：PPARPPAR 激动剂激动剂 吡格列酮吡格列酮 缺血再灌注损伤缺血再灌注损伤 药物预处理药物预处理 ATPATP 敏感性钾敏感性钾 通道通道 再灌注损伤救援激酶再灌注损伤救援激酶摘要：在工业化国家，缺血性心脏病是主要的死亡原因。目前针对冠心病的主 要治疗手段，包括溶栓、介入治疗、冠状动脉搭桥手术等，均是对缺血心肌实 施再灌注，而再灌注也会造成心肌细胞的损伤。缺血再灌注(ischemia-
2、reperfusion，I/R)损伤成为阻碍缺血心肌从再灌注疗法中获得最佳疗效的主要 难题。既往研究表明，各种不同的 PPAR(peroxisomeproliferator- activated receptor-，过氧化物酶体增殖物激活受体 )激动剂(包括罗格 列酮、曲格列酮和吡格列酮等)都可以减少心肌缺血再灌注损伤，发挥类似 IPC(ischemia preconditioning，缺血预处理)的作用，并对其机制作了一定的 研究。本研究利用原代培养的大鼠心肌细胞、急性分离的大鼠心肌细胞及成年 大鼠，在既往研究的基础上进一步探讨 PPAR 激动剂吡格列酮预处理抗大鼠心 肌缺血再灌注损伤的机制
3、。 1目的： 1.1观察 KATP(ATP-sensitive potassium channel，ATP 敏感性钾通道)在吡格列酮抗大鼠心肌细胞缺氧复氧 损伤中的作用； 1.2观察吡格列酮对急性分离大鼠心室肌细胞 KATP 电流的 影响； 1.3观察在大鼠心肌缺血再灌注损伤时心肌 ERK1/2、磷酸化 ERK1/2、p38、磷酸化 p38、TGF1、COX-2 及 HIF-1 表达的变化及吡格列酮 对其影响。 2方法： 2.1利用原代培养的新生 SD(Sprague-Dawley)大 鼠心肌细胞，分别予以 0.1、1.0、2.0M 浓度吡格列酮预处理 24h，同时分别 予以特异性 PPAR
4、受体阻断剂 GW9662、sarCKATP(sarcolemmal ATP- sensitive potassiumchannel，肌膜 ATP 敏感性钾通道)阻断剂 HMR-1098 和 mitoKATP(mitochondria ATP-sensitive potassium channel，线粒体敏感性钾 通道)阻断剂 5-HD(5-Hydro-xydecanoate，5-羟葵酸)处理后，建立缺氧复氧模 型，Annexin V-FITC/PI 双染法及 Hoechst33258 染色法检测心肌细胞凋亡：收 集心肌细胞，利用免疫印迹方法，RT-PCR 方法检测两种 KATP 亚单位 Kir
5、(inwardly rectifying K channel，内向整流钾通道)的表达。 2.2急 性分离成年 SD 大鼠心肌细胞，细胞缺氧后记录 KATP 电流，观察不同浓度吡格 列酮灌流细胞后对电流的影响； 2.3成年 SD 大鼠 30 只，分组后分别予以 5、10、20mgkg-1d-13 种浓度吡格列酮灌胃7d，灌胃后在体建立心肌缺 血再灌注损伤模型：结扎冠状动脉前降支 30min，复灌 30min，留取心肌组织， 利用免疫印迹方法、RT-PCR 方法检测 ERK1/2、磷酸化 ERK1/2、p38、磷酸化 p38、TGF1、COX-2 及 HIF-1 表达的变化及吡格列酮对其影响。 3
6、结果：3.1缺氧复氧后心肌细胞早期凋亡率升高(由空白组的 0.260.03增加 至 12.221.45，P0.05)，吡格列酮减少心肌细胞凋亡(各剂量组分别为 10.090.67、9.161.47、8.320.89)，仅 2.0M 组与缺氧复氧组比 较有统计学差异(P0.05)。PPAR 受体阻断剂 GW9662 阻断 2.0M 吡格列酮 抗心肌细胞凋亡的作用(12.461.62，P0.05)； 3.2mitoKATP 阻断剂 5-HD 削弱吡格列酮抗心肌细胞凋亡的作用(凋亡率 10.000.50，P0.05)， sarcKATP，阻断剂 HMR-1098 无明显影响(8.741.59，P0.
7、05)； 3.3吡格列酮上调 mitoKATP 亚单位 Kir6.1 mRNA 及蛋白的表达，PPAR，受 体阻断剂 GW9662 削弱这种上调作用；吡格列酮对 sarcKATP 亚单位 Kir6.2 mRNA 表达无明显影响； 3.4在急性分离成年 SD 大鼠心肌细胞，细胞缺氧 后成功诱发出 ATP 敏感性钾电流，不同浓度吡格列酮灌流细胞后对电流无明显 影响； 3.5缺血再灌注后，大鼠心肌 ERK1/2、p38 蛋白表达无明显变化， 磷酸化 ERK1/2、磷酸化 p38、TGF1、COX-2、HIF-1 表达上调；吡格列酮对 ERK1/2 表达无明显影响，上调磷酸化 ERK1/2 表达；对
8、p38 表达无明显影响， 下调磷酸化 p38 的表达；上调 TGF1mRNA、蛋白表达；上调 COX-2 mRNA、蛋白 表达；上调 HIF-1mRNA 表达。 4结论： 4.1吡格列酮预处理减轻心 肌细胞缺氧复氧后凋亡，这种作用部分通过激活 PPAR 途径实现； 4.2吡 格列酮可能通过上调 mitoKATP 通道亚单位表达、诱导 mitoKATP 开放发挥抗心 肌细胞凋亡作用，sarcKATP 未参与这种保护过程； 4.3吡格列酮抗心肌缺 血再灌注损伤可能与调节 RISK(Reperfusion InjurySalvage Kinase，再灌注 损伤救援激酶)的表达有关。正文内容正文内容在
9、工业化国家，缺血性心脏病是主要的死亡原因。目前针对冠心病的主要 治疗手段，包括溶栓、介入治疗、冠状动脉搭桥手术等，均是对缺血心肌实施 再灌注，而再灌注也会造成心肌细胞的损伤。缺血再灌注(ischemia- reperfusion，I/R)损伤成为阻碍缺血心肌从再灌注疗法中获得最佳疗效的主要 难题。既往研究表明，各种不同的 PPAR(peroxisomeproliferator- activated receptor-，过氧化物酶体增殖物激活受体 )激动剂(包括罗格 列酮、曲格列酮和吡格列酮等)都可以减少心肌缺血再灌注损伤，发挥类似 IPC(ischemia preconditioning，缺血
10、预处理)的作用，并对其机制作了一定的 研究。本研究利用原代培养的大鼠心肌细胞、急性分离的大鼠心肌细胞及成年 大鼠，在既往研究的基础上进一步探讨 PPAR 激动剂吡格列酮预处理抗大鼠心 肌缺血再灌注损伤的机制。 1目的： 1.1观察 KATP(ATP-sensitive potassium channel，ATP 敏感性钾通道)在吡格列酮抗大鼠心肌细胞缺氧复氧 损伤中的作用； 1.2观察吡格列酮对急性分离大鼠心室肌细胞 KATP 电流的 影响； 1.3观察在大鼠心肌缺血再灌注损伤时心肌 ERK1/2、磷酸化 ERK1/2、p38、磷酸化 p38、TGF1、COX-2 及 HIF-1 表达的变化及
11、吡格列酮 对其影响。 2方法： 2.1利用原代培养的新生 SD(Sprague-Dawley)大 鼠心肌细胞，分别予以 0.1、1.0、2.0M 浓度吡格列酮预处理 24h，同时分别 予以特异性 PPAR 受体阻断剂 GW9662、sarCKATP(sarcolemmal ATP- sensitive potassiumchannel，肌膜 ATP 敏感性钾通道)阻断剂 HMR-1098 和 mitoKATP(mitochondria ATP-sensitive potassium channel，线粒体敏感性钾 通道)阻断剂 5-HD(5-Hydro-xydecanoate，5-羟葵酸)处理
12、后，建立缺氧复氧模 型，Annexin V-FITC/PI 双染法及 Hoechst33258 染色法检测心肌细胞凋亡：收 集心肌细胞，利用免疫印迹方法，RT-PCR 方法检测两种 KATP 亚单位 Kir(inwardly rectifying K channel，内向整流钾通道)的表达。 2.2急 性分离成年 SD 大鼠心肌细胞，细胞缺氧后记录 KATP 电流，观察不同浓度吡格 列酮灌流细胞后对电流的影响； 2.3成年 SD 大鼠 30 只，分组后分别予以 5、10、20mgkg-1d-13 种浓度吡格列酮灌胃7d，灌胃后在体建立心肌缺 血再灌注损伤模型：结扎冠状动脉前降支 30min，复
13、灌 30min，留取心肌组织， 利用免疫印迹方法、RT-PCR 方法检测 ERK1/2、磷酸化 ERK1/2、p38、磷酸化 p38、TGF1、COX-2 及 HIF-1 表达的变化及吡格列酮对其影响。 3结果：3.1缺氧复氧后心肌细胞早期凋亡率升高(由空白组的 0.260.03增加 至 12.221.45，P0.05)，吡格列酮减少心肌细胞凋亡(各剂量组分别为 10.090.67、9.161.47、8.320.89)，仅 2.0M 组与缺氧复氧组比 较有统计学差异(P0.05)。PPAR 受体阻断剂 GW9662 阻断 2.0M 吡格列酮 抗心肌细胞凋亡的作用(12.461.62，P0.05
14、)； 3.2mitoKATP 阻断剂 5-HD 削弱吡格列酮抗心肌细胞凋亡的作用(凋亡率 10.000.50，P0.05)， sarcKATP，阻断剂 HMR-1098 无明显影响(8.741.59，P0.05)； 3.3吡格列酮上调 mitoKATP 亚单位 Kir6.1 mRNA 及蛋白的表达，PPAR，受 体阻断剂 GW9662 削弱这种上调作用；吡格列酮对 sarcKATP 亚单位 Kir6.2 mRNA 表达无明显影响； 3.4在急性分离成年 SD 大鼠心肌细胞，细胞缺氧 后成功诱发出 ATP 敏感性钾电流，不同浓度吡格列酮灌流细胞后对电流无明显 影响； 3.5缺血再灌注后，大鼠心肌
15、 ERK1/2、p38 蛋白表达无明显变化，磷酸化 ERK1/2、磷酸化 p38、TGF1、COX-2、HIF-1 表达上调；吡格列酮对 ERK1/2 表达无明显影响，上调磷酸化 ERK1/2 表达；对 p38 表达无明显影响， 下调磷酸化 p38 的表达；上调 TGF1mRNA、蛋白表达；上调 COX-2 mRNA、蛋白 表达；上调 HIF-1mRNA 表达。 4结论： 4.1吡格列酮预处理减轻心 肌细胞缺氧复氧后凋亡，这种作用部分通过激活 PPAR 途径实现； 4.2吡 格列酮可能通过上调 mitoKATP 通道亚单位表达、诱导 mitoKATP 开放发挥抗心 肌细胞凋亡作用，sarcKATP 未参与这种保护过程； 4.3吡格列酮抗心肌缺 血再灌注损伤可能与调节 RISK(Reperfusion InjurySalvage Kinase，再灌注 损伤救援激酶)的表达有关。 在工业化国家，缺血性心脏病是主要的死亡原因。目前针对冠心病的主要治疗 手段，包括溶栓、介入治疗、冠状动脉搭桥手术等，均是对缺血心肌实施再灌 注，而再灌注也会造成心肌细胞的损伤。缺血再灌注(ischemia- reperfusion，I/R)损伤成为阻碍缺血心肌从再灌注疗法中获得最佳疗效的主要 难题。既往研究表明，各种不同的 PPAR(peroxisomeproliferato
