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1、液相色谱的应用以及方法开发提纲：t一.HPLC的广泛应用t二.方法开发过程一）选择HPLC检测器二）分配色谱及选择流动相三）方法开发的具体步骤四）梯度洗脱方法一.HPLC的广泛应用 据2004年统计，世界上化合物总数多 达4700多万种 在全部有机化合物中仅有20左右的 样品适用于GC分析 而HPLC可对80左右的有机化合物进 行分离和分析HPLC的广泛应用 HPLC特别适用于高沸点、大分子、强极 性和热稳定性差的化合物以及生物活性物质 的分离和分析并且可以做制备 在医药、食品、农业、生命科学、化工、 环保等领域都有着广泛的应用潜力。HPLC的应用领域 在食品研究中的分析应用 食品中的天然成分
2、碳水化合物 类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇 脂肪酸和有机酸 蛋白、肽、氨基酸 食品添加剂酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂 抗氧化剂、防腐剂 颜料和染料（色素 维生素 污染物霉菌（黄曲霉毒素 农药残留和兽药残留 多环芳烃（PAHS和亚硝酸HPLC的应用领域 在医药研究中分析应用药物分析有USP、BP、CP等标准 常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定 药、心血管药、磺胺类消炎药等。 甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素 、雌性激素和孕激素等。 抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆 大毒素、四环素、氯霉素、诺氟沙星等。 中草药研究中的应用：生物碱、甙类(皂甙、强心甙、 黄酮
3、甙等)、萜类 手性药物研究中的应用：光学异构体的拆分(如解毒剂 D-青霉胺毒性小，L-异构体毒性很强) 医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学 研究。v 在兽药研究中分析应用HPLC 的应用领域 在生物化学和生物工程中的应用氨基酸、多肽合成和蛋白质的分析研究 核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究生物胺的分析研究（儿茶酚胺类) 在精细化工分析中的应用醇、醛和酮、醚的分离分析 酸和酯的分离分析 表面活性剂的分析 聚合物的分析研究 药物、农药、染料、炸药等工业产品HPLC的应用领域化妆品行业要控制和分析：防腐剂、防晒剂、性激素以及维生素等；在公安、刑警破案工作需要投毒药物、毒品分析等在环境污染
4、分析中的应用 废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药 残留、酚类和胺类的检测 在无机离子分析中应用饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析 二.方法开发的过程Adapted from: Snyder, L.R.; Kirkland, J.J.; Glajch, J.L; Practical HPLC Method Development 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1997, p. 21. 1. 得到样品信息，确定分离目标得到样品信息，确定分离目标2. 2. 确定特定确定特定HPLCHPLC过程、样品预处理等的需求过程、样品预处理等的需求3.
5、 3. 选择合适的检测器选择合适的检测器4. 4. 选择选择HPLCHPLC方法；初步分离；建立最佳分离条件方法；初步分离；建立最佳分离条件5. 5. 优化分离条件优化分离条件6. 6. 检查特定过程的问题及需要检查特定过程的问题及需要7. 7. 定量校正定量校正8. 8. 日常使用的确认日常使用的确认第一步干什么?t想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类 似样品的分析方法 查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA- 仪器制造商的文献，如Dionex,Waterst对色谱柱有足够的了解掌握分离机理，自己开发方法t充分了解您自己的样品分析时要了解哪方面的情况？t灵敏度的要求
6、有多高? t样品的本底是否很复杂? t有多少组份要分析? t对分析的精确度、准确度等有多高要求? t是否因是日常检验，而要求方法容易使用? 分离(制备)时要了解哪方面的情况？t要分离（即制备）的样品量有多大? t要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? t是否需要保持生物活性? t对分离产物纯度的要求有多高? t纯度或活性的鉴定如何完成?使用文献方法注意点t色谱柱填料的种类、品牌是否相同?t注意文献方法的流动相 是否损害色谱柱?如色谱填料品牌不同，需要调整流动相t注意色谱柱的规格：内径、柱长 需要调整流速、进样量t注意梯度条件t了解系统的滞后体积（梯度）一）选择HPLC检测器t对样品有响应
7、并有一个输出信号t应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性 关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系但是：t由于受HPLC系统其他部件的影响会产生响应与 浓度之间关系的与线性偏离现象t并不是所有的检测器是线性的t受HPLC系统其他部件的影响，检测器的表现可 能与其最佳水平有较大的差距用于HPLC的检测器t没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相 色谱分离！HPLC检测器可以分为：t溶质性质检测器（选择型） 对溶质的物理或化学性质响应，一般不反 应流动相的变化（选择型）t整体性质检测器（通用型） 不管是否有溶质，对流动相任何物理性质 的变化作出响应（通用型）理想的HPLC检测器t高灵敏度；
8、可忽略的基线噪音t宽的线性范围t独立于流动相及操作参数的响应 对压力、温度及流速等变化不敏感t长时间操作的稳定性t低死体积t非破坏性t选择性灵敏度：信噪比t灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音 的比值（S/N）t检测限（LOD）：S/N = 3t定量限（LOQ）：S/N = 10t好的信噪比有利于： 更好的色谱峰确认 更好的定量 更好地完成色谱峰纯度/均一性6:1NS选择液相色谱的检测器要考虑的因素： t你要分离的化合物/样品的化学特性化学结构、分子量及紫外光谱等等t流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等）t梯度还是等度t灵敏度需求t是否有双检测的需求选择液相色谱的检测器通用检测器 RI E
9、LSDMS 灵敏度ugngpg 线性范围104否103 流速敏感是否是 温度敏感是否否 破坏性否是是选择性检测器 ABSFLEC Cond MS 灵敏度ngpgfgpgpg 线性范围105103106105103 流速敏感否否是是是 温度敏感否否是是是 破坏性否否是否是吸光度（ UV/Vis）检测原理原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收定量基础：比耳定律，AKCL优点：1）对温度和流速不敏感2）可用于梯度洗脱3） 灵敏度较高，ng级检测缺点：选择性检测器，仅适用于测定有紫外吸收的物质吸光度（ UV/Vis）检测的应用大多数有机化合物有一定程度的吸光度，可以测 定大多数的化合物，是目
10、前实验室中使用最多的 检测器-多数公司售出的检测器中75%以上是吸 光度检测器（其中50%以上是紫外/可见检 测器，25%是PDA）背景吸收的影响背景吸收降低背景吸收降低 了线性范围了线性范围多数流动相有多数流动相有 紫外吸收紫外吸收实际浓度理想10吸光度210背景吸收背景吸收光电二极管矩阵（Photo Diode Array） Photo Diode ArrayPhoto Diode Array简称：简称：PDAPDA或或DADDAD光电二极管矩阵检测器（ PDA ）的特点和用途 一种三维水平的吸光度检测器-采集三维谱图 兼顾紫外检测器及可见分光光度计的信息 在收集色谱图的同时，得到光谱图
11、提供许多有用的功能-色谱峰的纯度鉴定，色谱峰的确认-可以发现单波长检测时未测到的峰-任意波长的色谱再处理-光谱信息-光谱库的建立检索和拟合荧光（Fluorescence）检测原理原理：发荧光的化合物吸收光（UV或VIS） 使其分子达到激发态，当其返回到基态时发 射光的现象即荧光优点：荧光检测器灵敏度高, pg级检测缺点：不是所有化合物都有荧光，必要时需 要衍生荧光检测器原理荧光检测器的应用 环境中的污染物 多环芳烃 (PAH)，多酚，氨 基甲酸酯等 食品、饮料 食品中的毒素 ；例如：黄曲霉毒 素 染料 维生素及衍生 氨基酸 生物技术及制药氨基甲酸酯类杀虫剂黄曲霉毒素多环芳烃（PAH）维生素示差
12、折光（Refractive Index）检测t示差折光检测器（RI）是第一个商品化的液相色 谱检测器（上世纪六十年代末、七十年代初） 通常被认为是一种通用检测器 检测溶液中所有被溶解的溶质 非特异 性t任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质中 与真空中的速度之比值R RS S示差折光（RI ）检测 的原理原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样各组分浓度。优点：通用型检测器缺点： 1）对温度变化敏感2）不能用于梯度检测3）灵敏度低，ug级检测返回示差检测器的应用示差折光检测器是通用型检测器,如果选择 合适的溶剂，几乎所有的物质都可以检测特别适用于检测没有紫外吸收的化合物,例 如糖类,醇类,
13、酯类以及脂肪酸等高分子化合物GPC,GFC分析以及复杂样品纯 化蒸发光散射（ELSD）原理t用氮气把流动相吹成细雾状t流动相的液滴通过一个预加热的腔体后被蒸发掉t蒸发的溶剂被从检测器中除去t溶质的挥发性小于流动相，因此产生颗粒束与光 束相交t被颗粒散射的光由光电倍增管（PMT）收集tPMT的输出与溶质的存在量呈比 例关系ELSD 优点及应用领域t通用型 比流动相挥发性小的物质都能被检测 可以作梯度实验； 检测下限可到纳克级水平 对环境条件不敏感；可以使用有强紫外吸收的溶 剂作流动相 t应用领域： 碳水化合物 油脂及脂肪酸 未衍生的氨基酸 制药行业 表面活性剂 天然产物ELSD 缺点t不能使用不
14、挥发性的流动相（例如：磷酸盐）t要求使用雾化气源（典型的是氮气或空气） t不同的色谱条件下雾化及除溶剂的参数需要重新 优化 t破坏性技术 t蒸发出的溶剂要引到户外或通风橱里 t对挥发性化合物的检测不理想t一般得到的是非线性校正曲线t某些化合物的检测灵敏度不如其他检测器二）色谱基本分类t色谱基本分类：按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以分为：1.分配色谱分配系数 *2.亲和色谱亲和力3.吸附色谱-吸附力4.离子交换色谱离子交换能力5.凝胶色谱（体积排阻色谱）-分子大小引起的体积排阻分配色谱分配色谱分为：正相色谱：固定相（填料）为极性，流动相为非极性反相色谱：固定相（填料）为非极性，流动
15、相为极性。用得最多，约占60-70%相对应的色谱柱：反相柱：烷基硅烷键合硅胶填料，如C18（ODS）C8,C4,C3，苯基等正相柱：典型的为硅胶柱，其它官能团为-CN氰基，-NH2氨基等分配色谱的分离机理分配色谱概述t反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离t洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱流动相极性流动相洗脱强度反相色谱最常用的流动相及其洗脱强度：水 2%Acclaim 120, C18, 5 m, 4.6 x 100 mm; 0.5 mL/min; 25C; 5 L injection volume; UV detection at 256 nm; Eluent (A) Water
16、and (B) Acetonitril; Gradient: 30 % b to 100 % B in 10 min; Methyl-, Ethyl-, Propyl- and Butylparabene, 10 mg/L each梯度洗脱的特点t优点 缩短分析时间 增加分离能力 检测灵敏度提高 t缺点 仪器设备要求高 不适合某些检测方式(RI) 柱需再生平衡 定量分析的重复性较低？一般流出问题n早流出峰的分离度差.n迟流出峰的峰宽增加而峰高降低.n由于k范围宽，所以分析时间长.n强保留组分造成柱污染.等梯度洗脱 - 在洗脱样品的整个过程中，流动相的组成保持不变.Analytical Education Center H5929A
