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1、相差显微镜的相差显微镜的特点特点 光线通过比较透明的标本时，光的波长 （颜色）和振幅（亮度）都没有明显的 变化。因此，用普通光学显微镜观察未 经染色的标本（如活的细胞）时，其形 态和内部结构往往难以分辨。 相差显微镜能通过其特殊装置环状 光阑和相板，利用光的干涉现象，将光 的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差 （明暗差），从而使原来透明的物体表 现出明显的明暗差异，对比度增强，使 我们能比较清楚的观察到普通光学显微 镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清 的活细胞及细胞内的某些细微结构相差显微镜的相差显微镜的成像原理成像原理镜检时光源只能通过环状光阑的透明环，经聚光器后聚 成光束，这束光线通过被检物
2、体时，因各部分的光程不 同，光线发生不同程度的偏斜（衍射）。由于透明圆环 所成的像恰好落在物镜后焦点平面和相板上的共轭面重 合。因此，未发生偏斜的直射光便通过共轭面，而发生 偏斜的衍射光则经补偿面通过。由于相板上的共轭面和 补偿面的性质不同，它们分别将通过这两部分的光线产 生一定的相位差和强度的减弱，两组光线再经后透镜的 会聚，又复在同一光路上行进，而使直射光和衍射光产 生光的干涉，变相位差为振幅差。这样在相差显微镜镜 检时，通过无色透明体的光线使人眼不可分辨的相位差 转化为人眼可以分辨的振幅差（明暗差）。相差显微镜的相差显微镜的结构和装置结构和装置 1、环状光阑 具有环形开孔的光阑。位于聚光
3、器的 前焦点平面上，光阑的直径大小是与 物镜的放大倍数相匹配的，并有一个 明视场光阑，与聚焦器一起组成转盘 聚光器。在使用时只要把相应的光阑 转到光路即可。相差显微镜的相差显微镜的结构和装置结构和装置 2、相板 位于物镜内部的后焦平面上。相板上有两 个区域，直射光通过的部分叫“共轭面”， 衍射光通过的部分叫“补偿面”。带有相板 的物镜叫相差物镜，常以“Ph”字样标在物 镜外壳上。 相板上镀有两种不同的金属膜：吸收膜和 相位膜。吸收膜常为铬、银等金属在真空 中蒸发而镀成的薄膜，它能把通过的光线 吸收掉60%93%，相位膜为氟化镁等在 真空中蒸发镀成，它能把通过的光线相位 推迟1/4波长。相差显微
4、镜的相差显微镜的结构和装置结构和装置 3、合轴调节望远镜 是相差显微镜一个极为重要的结构。环状光阑的像 必须与相板共轭面完全吻合，才能实现对直射光和 衍射光的特殊处理。否则应被吸收的直射光被泄掉 ，而不该吸收的衍射光反被吸收，应推迟的相位有 的不能被推迟，这样就不能达到相差镜检的效果。 由于环状光阑是通过转盘聚光器与物镜相匹配的， 因而环状光阑与相板常不同轴。为此，相差显微镜 配备有一个合轴调节望远镜（在镜的外壳上标有 “CT”符号），用于合轴调节。使用时拨去一侧目镜 ，插入合轴调节望远镜，旋转合轴调节望远镜的焦 点，便能清楚看到一明一暗两个圆环。再转动聚光 器上的环状光阑的两个调节钮，使明亮
5、的环状光阑 圆环与暗的相板上共轭面暗环完全重叠。如明亮的 光环过小或过大，可调节聚光器的升降旋钮，使两 环完全吻合。如果聚光器已升到最高点或降到最低 点而仍不能矫正，说明玻片太厚了，应更换。调好 后取下望远镜，换上目镜即可进行镜检观察。相差显微镜的相差显微镜的结构和装置结构和装置 4、绿色滤光片 由于使用的照明光线的波长不同， 常引起相位的变化，为了获得良好的 相差效果，相差显微镜要求使用波长 范围比较窄的单色光，通常是用绿色 滤光片来调整光源的波长。 Olympus厂家生产的相差显微镜在 镜检时要使用该厂规定的IF550绿色 滤光片作为配套器件。相差显微镜的相差显微镜的使用范围使用范围 相差
6、显微镜能观察到透明样品的细 节，适用于对活体细胞生活状态下 的生长、运动、增殖情况及细微结 构的观察。因此，是微生物学、细 胞生物学、细胞和组织培养、细胞 工程、杂交瘤技术等现代生物学研 究的必备工具。相差显微镜的相差显微镜的操作步骤操作步骤 （1）根据观察标本的性质及要求，挑选适合 的相差物镜。 （2）将标本片放到载物台上。 （3）进行光轴中心的调整。 （4）取下一侧目镜，换上合轴调节望远镜， 调整环状光阑与相板上的共轭面圆环完全重叠 吻合，然后取下合轴调节望远镜，换回目镜。 在使用中，如需要更换物镜倍数时，必须重新 进行环状光阑与相板共轭面圆环吻合的调整。 （5）放上绿色滤光片，即可进行镜
7、检，镜检 操作与普通光学显微镜方法相同。相差显微镜的相差显微镜的注意事项注意事项 （1）视场光阑与聚光器的孔径光阑 必须全部开大，而且光源要强。因环 状光阑遮掉大部分光，物镜相板上共 轭面又吸收大部分光。 （2）不同型号的光学部件不能互换 使用。 （3）载玻片、盖玻片的厚度应遵循 标准，不能过薄或过厚。 （4）切片不能太厚，一般以5 10m为宜，否则会引起其他光学现 象，影响成像质量。荧光显微镜荧光显微镜 荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的 基本工具。它是由光源、滤板系统 和光学系统等主要部件组成。是利 用一定波长的光激发标本发射荧光 ，通过物镜和目镜系统放大以观察 标本的荧光图像。 荧光是什么？
8、荧光显微镜荧光显微镜- -光源光源 多采用200W的超高压汞灯作光源 国产超高压汞灯GCQ-200型性能 良好，可以代替HBO-200等型的 进口灯泡荧光显微镜荧光显微镜- -滤色系统滤色系统 滤色系统是荧光显微镜的重要部位，由激发滤板和压制滤板组成。滤 板型号，各厂家名称常不统一。滤板一般都以基本色调命名，前面字 母代表色调，后面字母代表玻璃，数字代表型号特点。荧光显微镜荧光显微镜- -滤色系统滤色系统1激发滤板 根据光源和荧光色素的特点，可选用以下三类激发滤 板，提供一定波长范围的激发光。 紫外光激发滤板：此滤板可使400nm以下的紫外 光透过，阻挡400nm以上的可见光通过。常用型号为
9、UG-1或UG-5，外加一块BG-38，以除去红色尾波。 紫外蓝光激发滤板：此滤板可使300450nm范围 内的光通过。常用型号为ZB-2或ZB-3，外加BG-38。 紫蓝光激发滤板：它可使350490nm的光通过。 常用型号为QB24（BG12）。 最大吸收峰在500nm以上者的荧光素（如罗达明 色素）可用蓝绿滤板（如B-7）激发。荧光显微镜荧光显微镜- -滤色系统滤色系统 2压制滤板 压制滤板的作用是完全阻挡激发光通过，提供 相应滤长范围的荧光。与激发滤板相对应，常 用以下3种压制滤板： 紫外光压制滤板：可通过可见光、阻挡紫 外光通过。能与UG-1或UG-5组合。常用GG- 3K430或G
10、G-6K460。 紫蓝光压制滤板：能通过510nm以上滤 长的荧光（绿到红），能与BG-12组合。通常 用OG-4K510或OG-1K530。 紫外紫光压制滤板：能通过460nm以上 波长的荧光（蓝到红），可与BG-3组合，常 用OG-11K470AK 490，K510。荧光显微镜荧光显微镜- -目镜目镜 在荧光显微镜中多用低倍目镜，如 5和6.3。荧光显微镜荧光显微镜标本制作要求标本制作要求 载玻片厚度应在0.81.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另 一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无 明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。 盖玻片厚度在0.17mm左右，光
11、洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻 片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用 的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发 光，这种反射的激发光女可激发标本。 组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部 ，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖 ，影响判断。 封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5 9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.09.5的 碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。 般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用 特制的无荧光镜油，也
12、可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折 光率较低，对图像质量略有影响。使用荧光显微镜的使用荧光显微镜的注意事项注意事项 （1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变 程序 （2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞 灯515min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察 标本。 （3）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。 （4）检查时间每次以12h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强 度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射35min后，荧光也明显减 弱；所以，最多不得超过23h。 （5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节 省时间， 保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用 时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避 免数次点燃光源。 （6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本 放在聚乙烯塑料袋中4保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。 （7）荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“一”无或可见微弱 荧光。“+”仅能见明确可见的荧光。“+”可见有明亮的荧光。“+” 可见耀眼的荧光。
