遗传修饰动物模型

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1、 第十三章遗传修饰动物模型Date1第一节转基因动物的概念及其发展简史转基因动物(transgenic animal)： 是指基因组中整合有外源基因、外源基因 能够表达并按孟德尔定律遗传的一类动物 。转基因(transgene)： 将外源基因整合入动物基因组中的操作。 嵌合体动物(chimera)： 部分组织中整合有外源基因的动物。Date2第一节转基因动物的概念及其发展简史转基因的三个层次：细菌转基因离体真核细胞转基因生物转基因Date3第一节转基因动物的概念及其发展简史人类疾病动物模型(Animal models of human diseases)是指在医学研究中，在动物身上建立，或形成

2、类似人类疾病动物。通过动物模型直接，或间接反映疾病的发生和发展过程，在了解疾病的基础上开创和改进、优化疾病的治疗。 Date4第一节转基因动物的概念及其发展简史 转基因技术是在基因工程和胚胎工程的基础 上发展起来的 1961年，Tarkowski等将小鼠卵裂期不同品系 的胚胎细胞融合后，形成了嵌合体小鼠； 1974年，Jaenisch和Mintz将SV40DNA注射入 小鼠囊胚中，在小鼠的体细胞检测到病毒 DNA序列； 1980年，Gordon首次将重组的DNA注射到 小鼠体细胞中；Date5第一节转基因动物的概念及其发展简史1982年，Palmiter将金属巯基(MTI)基因启 动子控制的大

3、鼠生长激素基因转入侏儒小 鼠的受精卵，得到的7只转基因鼠中，有6 只生长明显加快，体重远大于正常对照， 被称为“超级小鼠”(Supermice)。 82年以后，转基因技术得到了大力的推广 和研究，至今已制备出小鼠、大鼠、鸡、 兔、猪、羊、鱼等转基因品系。Date6 1、第一例嵌合体小鼠 1974年最早把猿猴病毒40(SV40)注入小鼠囊胚腔中得到部分组 织中含有SV40DNA的嵌合体小鼠。但无任何表型改变。 2、第一个转基因小鼠系 1976年建立了世界上第一个转基因小鼠系，这些小鼠基因组中插人了莫氏白血病病毒基因。他们是运用反转录病毒与小 鼠卵裂球共培养把外源DNA插入到小鼠的基因组中。 3、

4、第一例显微注射法产生转基因小鼠 1980年，Gordn等把SV40DNA显微注射到小鼠受精卵的原核中，获得了两只转基因小鼠，创建了显微注射转基因方法。Date7 4、“超级鼠” 1982年，Palmiter和 Brinster用此方法把大鼠的生长激素基因 导入小鼠受精卵，获得了成年体重是对照 组小鼠2倍的“超级鼠”，首先证明外源基因可在受体中表达，并且表达产物具有生 物活性。 5、转基因家畜的产生转基因家兔、绵羊和 猪(Hammer等，1985)、牛(Bondioli等， 1988)和山羊(Ebert等，1991)等相继出世 。Date8Date9Date106、利用转基因生产重组蛋白1987

5、年，Simons等在转基因小鼠的乳汁中得到绵羊的-球蛋白，1988年，该研究小组又从转基因绵羊的乳汁中 得到了-抗胰蛋白酶。目前，已有数十种蛋白实现了转 基因生产。7、转YAC的转基因小鼠近10年内，陆续出现用全长酵母人工染色体（YAC）DNA来产生转基因小鼠。Date11 东北农业大学国内首例绿色荧光蛋白“转基因 ”克隆猪 绿色荧光蛋白猪胎儿成纤维细胞克隆Date12 1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊 在英国著名的罗斯林研究所诞生。转基因 母羊的乳汁中可以分泌-抗胰蛋白酶。Date13 2010年，FDA批准转基因鲑鱼Date14转基因动物的意义： 基因的整体功能的阐明只有在活体内通

6、过 整体动物的研究才能达到； 转基因动物是生物医学研究、新药开发、 毒理学、安全性评价的重要工具。 转基因动物用途： （l）疾病型转基因动物；（2）利用转基 因动物制药；（3）动物改良型；（4）基 础生物学研究第一节转基因动物的概念及其发展简史Date15 （l）疾病型转基因动物 替代： 避免了人体实验造成的风险和伦理问题。 潜伏期长，病程长和发病率低的疾病 可控： 品系，感染病原体 实验环境 方便： 样品收集 结果分析容易（统计）； 人畜共患病比较，研究疾病机理Date16 （2）利用转基因动物制药： 生物反应器重组蛋白药物 欧洲医药评价署人用医药产品委员会 2006年6月2日首次 批准了用

7、转基因山羊奶研制而成的抗血栓药物Atryn（抗凝血酶）上市 目前世界上还有利用转基因绵羊、牛和兔乳腺生物反应器 生产的人-抗胰蛋白酶（抗蛋白酶缺乏性肺气肿药物）、 重组组织血纤维蛋白溶酶原激活剂（抗栓药）和人C1抑 制剂（治疗血管神经性水肿的药物）等重组蛋白药物也已 经完成或进入临床期试验，特别是治疗性抗体药物，发 展潜力更大。 Date17 目前已在下列动物的乳汁中生产出一些人类蛋白质药 物： 牛：抗凝血酶、纤维蛋白原、人血清白蛋白、胶原蛋 白、乳铁蛋白、糖基转移酶、蛋白C等； 山羊：抗凝血酶原、抗胰蛋白酶、血清白蛋白、组织纤溶原激活因子、单克隆抗体等； 绵羊：抗胰蛋白酶、凝血因子、蛋白C；

8、 猪：凝血因子、蛋白C、纤维蛋白原、血红蛋白。Date18第二节 研制转基因动物的基本步骤1.转基因载体的构建2.将外源基因引入受体胚胎3.通过胚胎移植和基因型鉴定获得携带 外源基因的转基因动物4.通过转基因动物的表型分析研究外源 基因的功能Date19第二节 研制转基因动物的基本步骤基本原理将改建后的目的基因用显微注 射等方法注入实验动物的受精卵，然 后将此受精卵再植入受体动物的输卵 管中，使其发育成携带有外源基因的 转基因动物，人们可以通过转入外源 基因培育优良品种的工程动物等。Date20目的基因的分离与克隆表达载体构建卵母细胞的收集体外成熟培养基因导入转基因胚胎的获得获得子代动物转基因

9、胚胎的移植转基因整合表达的检测获得转基因动物受体动物的选择Date21构建转基因载体含有外源目的基因的重组载 体导入受体胚胎转基因胚胎的发育及鉴定通过转基因动物表型分析研究外源基因的功能Date22转基因动物的技术路线 经典的技术路线 目的基因显微注射已交配的 受体动物 供体动物 输卵管 转基因动物取出 移植 妊娠缺点：注入目的基因的命中率低，目的基因的整 合率低，受精卵移植的受孕率低。受精卵Date23转基因动物的技术路线(续) 整合胚胎移植的技术路线转基因动物 受体动物子宫目的基因 非手术胚胎移植体外受精 体外培养 检测 卵子 受精卵 多细胞胚胎 整合外源基因 精子 或囊胚 的胚胎优点：受

10、精卵的成活率高达90以上，外源基因整合率高， 提高受孕率。Date24转基因动物的技术路线（续） 整合卵受精的技术路线：目的基因 转基因动物导入逆转录病毒 妊娠 精子感染 体外受精 胚胎移植 卵母细胞 成熟卵细胞 囊胚 受体动物子宫 特点：卵母细胞导入目的基因后再与精子受精。Date25转基因动物的技术路线（续） 核移植（克隆）的技术路线目的基因 转基因动物 导入动物胚胎成纤维细胞 妊娠取核动物 重组的 囊胚期 受体动物 卵细胞 受精卵 胚胎 子宫 去核 体外培养 胚胎移植 特点：体细胞核移植；核移植前导入目的基因。Date26表达调控元件目的基因 报告基因 如果观察外源基因表达所引起的生物学

11、效 应，可选择表达水平高而无组织特异性的 强启动子，如CMV、pGK等； 如果希望观察外源基因在特定组织器官中 的功能，应选用组织特异性启动子，如肝 蛋白启动子、胰岛素启动子等； 可诱导型启动子调控外源基因的表达。Date27 1.外源目的基因的分离 2.外源目的基因与转性基因表达启动子、增强子、报告基因等构件的拼接重组 3.重组DNA导入生殖细胞或胚胎干细胞 4.胚胎移植技术 5.鉴定及筛选 6.目的基因整合率及表达效率的检测转基因动物的关键技术包括Date28第二节 研制转基因动物的基本步骤转基因载体的构建及制备转基因载体的要求： 启动子目的基因 报告基因 多聚腺苷酸化信号绝缘子Date2

12、9第二节 研制转基因动物的基本步骤启动子：组成型启动子组织特异型启动子诱导型启动子诱导型组织特异型启动子Date30第二节 研制转基因动物的基本步骤Kozak序列（ACCAUGG）： 核糖体能够识别mRNA上的这段序列，并把 它作为翻译起始位点。注意这段序列并不是 ribosomal binding site (RBS)核糖体结合位点 ，而是帽子结构。 真核生物基因中起始密码子上下游的最佳序 列为，-3位为嘌呤碱基；+4位为G，起始密 码子AUG中的A处于+1位。A/GCCAUGG被 称为kozak序列或扫描序列。 Date31第二节 研制转基因动物的基本步骤KOZAK是一个女科学家，她研究过

13、起始密 码子AUG周边碱基定点突变后对转录和翻 译所造成的影响，并总结出在真核生物中 ，起始密码子两端序列为： G/N-C/N- C/N-ANNAUGG，如GCCACCAUGG 、GCCAUGAUGG时，转录和翻译效率最 高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。 该序列被后人称为Kozak序列，并被应用于 表达载体的构建中。 Date32第二节 研制转基因动物的基本步骤Kozak规则，即第一个AUG侧翼序列的碱 基分布所满足的统计规律，若将第一个 AUG中的碱基A，U，G分别标为1，2，3 位，则Kozak规则可描述如下： (1)第4位的偏好碱基为G； (2)AUG的5端约15bp范围的侧翼序

14、列内 不含碱基T； (3)在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基； (4)除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C 是偏好碱基。 Date33Date34第二节 研制转基因动物的基本步骤绝缘子：在基因组内建立独立的转录活性 结构域的边界DNA序列称为绝缘子/隔离子 （insulator）。绝缘子能够阻止邻近的增强 子或沉默子对其界定的基因的启动子发挥 调控作用。 Date35绝缘子元件阻断邻近增强子的活性Date36第二节 研制转基因动物的基本步骤目的基因 以往构件目的基因时一般使用基因文 库中的cDNA序列，实践证明仅有 cDNA序列往往难以得到有效表达， 至少一个内含子与cDNA序列结合会 使基因得到更好的表达，常使用基因 组DNA。Date