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1、实验九：聚丙烯酰胺凝胶电泳法 分离血清蛋白质教 师：王丽华实验目的1、熟悉电泳的基本原理 2、掌握PAGE的基本原理与操作技术具体安排 上午:制胶、原理讲解 中午：电泳（午餐） 下午：染色，脱色、观察结果电泳的基本原理电泳：是指带电粒子在电场中向着与其所带相反电 荷的电极方向移动的现象。应用:蛋白质、核酸和氨基酸等物质的分离和鉴定 。带电粒子的运动速度-迁移率 即带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。 = Q X /6rQ 粒子所带电荷量X 电场强度r 粒子半径 介质的粘度影响电泳速度的因素1、内在因素: 样品自身性质2、外在因素: 电场缓冲液支持介质a. 电荷b. 分子大小c. 形状v=QX/
2、6r内因：待分离大分子的性质电场（三要素）电流： 与电流成正比电压： 与电压成正比 常压电泳（100-500V）高压电泳（500-10000V）电阻： 与电阻成反比 缓冲液pH：为电泳提供了恒定的pH 值和适宜的离子强度解离性质解离程度运动方向电荷量一般所用离子强度为0.02-0.2之间 离子强度：强度过低，缓冲能力差，难以维持pH恒定，同 时样品扩散严重； 强度过高，减缓样品的迁移率。支持介质（物） 吸附:支持介质对样品的滞留作用,可导致样品的拖尾。 电渗：在电场中液体对固体支持物的相对移动。当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动 速度；反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。 分子
3、筛：是凝胶电泳的一个特性。筛孔越小，则颗粒在 移动的过程中所受到的阻力也就越大。电泳分类按按支持介质的不同可分为支持介质的不同可分为 纸电泳 醋酸纤维薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE实验原理N N，NN甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺( (BisBis) )单体交联剂催化剂加速剂丙烯酰胺丙烯酰胺( (AcrAcr) )过硫酸铵过硫酸铵/ /核黄素核黄素N N，N N，NN，NN四甲基乙二胺（四甲基乙二胺（TEMEDTEMED ）聚丙烯酰胺凝胶：丙烯酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺( (AcrAcr) )和交联剂和交联剂N N，N
4、N，甲甲叉双丙烯酰胺叉双丙烯酰胺( (BisBis) )在催化剂和加速剂的作用下聚在催化剂和加速剂的作用下聚 合而成的三维网状结构的凝胶。合而成的三维网状结构的凝胶。丙烯酰胺丙烯酰胺( (AcrAcr) )N N，NN甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺( (BisBis) )分类（根据有无浓缩效应）连续电泳： 电泳体系中缓冲液组成、pH值及凝胶孔径大小都相同。电荷效应、分子筛效应不连续电泳：电泳体系中缓冲液组成、pH值及凝胶孔径大小都不相同。电荷效应 、分子筛效应、浓缩效应不 连 续 电 泳分离胶浓缩胶电极缓冲液凝胶孔径小大缓冲体系离 子组成Tris-HClTris-HClTris-GlypH值8.
5、96.78.3浓缩效应浓缩胶,大孔胶, Tris-HCl,pH6.71. 凝胶孔径的不连续性2. 缓冲体系离子成分及pH值的不连续性快离子(前导离子): 氯离子 Cl-慢离子(尾随离子): 甘氨酸根 NH2CH2COO-样品中蛋白质的泳动速度介于这两种离子之间3. 电位梯度的不连续性_ _+Tris/甘氨酸 pH 8.3Tris/HCl pH 8.9分子筛效应分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径 的分离胶时，其受阻滞的程度不同而表现出不同 的迁移率。电荷效应进入pH8.9的分离胶中,各种蛋白质所带净电荷量不同而有不同的迁移率。表面电荷多,则迁移快;反之,则慢.分离胶（小孔胶） pH8.9分离
6、胶,浓缩胶实验操作一、制胶(本实验的关键步骤)1、安装玻板：将洗净的、带白色边条的玻板水平放好，将U型硅胶密封条摆好。然后，将不带边条的短玻板盖在U型硅胶密封条上。 2、安装铁夹：用4只铁夹将安装好的玻板夹 好。 注意：1）夹子的作用点应和白色边条重合，避免夹到边条内侧，造成玻板变形。2） 玻板下沿的两个夹子尽量下移，使之能够起到“腿”的作用，保 证玻板处于直立状态。 3、配制聚丙烯酰胺凝胶:每种试剂用相应的吸量管、滴 管来吸，吸量管上有标记。不可混用，否则污染试剂，影响 实验结果。分离胶的配制小烧杯中按下列顺序加入：（B液有毒性，尽量不 要接触到皮肤）1A液（Tris-HCl） 1 ml2B
7、液（Acr-Bis） 2 ml3蒸馏水 1 ml4过硫酸铵 (现配） 5 ml 前面四项加完后，混匀5TEMED 1滴（是加速剂 ，加入后很快就会凝固，所以最后加，加完后稍 事混匀就灌注）灌注分离胶将配制好的分离胶轻轻混匀，注意不要产生气泡 快速倒入电泳槽两玻璃板之间的缝隙中，不要产生 气泡。 液面高度应距离短玻璃板上缘约2-3厘米左右，上 面灌制浓缩胶。 灌制完成，放于水平处不要再动，约15-20分钟可 以聚合（聚合时间与室温和加样准确度有关）。 烧杯中的胶不要扔掉（化学聚合）聚胶过程讲理论另一小烧杯中按下列顺序加入：（D液有毒性，尽 量不要接触到皮肤）1C液（Tris-HCl） 0.4 m
8、l2D液（Acr-Bis） 0.8ml3E液(核黄素） 0.3 ml4过硫酸铵 0.6 ml5蒸馏水 0.9 ml混匀6TEMED 1-2滴浓缩胶的配制轻轻混匀，快速倾倒进玻璃板间的缝隙,液 面高度与矮板相平。插入样品槽模板（又称梳子），不要带进气泡。整个装置在紫外线下照射30分钟，使浓缩胶充分聚合（光聚合）。灌制浓缩胶聚胶过程讲理论每四组配制一份，再分装成4小份即可。1血清 0.3 ml （吸血清的吸量管用后要马上清洗，以免堵塞）2C液 1.0 ml320%或40%的蔗糖 3.0 ml40.05%溴芬兰 0.4 ml （思考2：为什么加2、3、4这三种液体？） 配制样品液安装电泳槽,加入电极
9、缓冲液（ F液）1.除去夹子及密封硅胶条,将玻璃夹板、电泳槽内芯、 有机玻璃平板依次放入槽内。(注意：两玻璃夹板的 矮板应与电泳槽内芯接触。)然后插入楔型板以固定 玻璃夹板。 2. 在外水槽加电泳缓冲液（F液）至槽体一半的位置 ，倾斜槽体，使玻璃夹板下沿中的气泡逸出。放正 槽体，继续加注缓冲液，使内外槽F液的水位均超过 矮板，但不能超过高板。 3. 将梳子轻轻取出，让F液进入梳子形成的加样槽中 ，准备加样品。加样:加样器针尖贴着高玻璃板伸到加样槽 中间位置加样，针尖不要扎破下面的胶面 。加样量:10 ul -50 ul加样电泳1)加样完毕后，将电泳槽盖好盖，与电泳仪相连 接。 2)电泳仪电压调
10、至最大，电流调到最小，打开电 泳仪开关进行恒流电泳。3)浓缩胶:30mA(150V)分离胶:40mA(200V)加样后马上将微量加样器仔细冲洗多遍，以免血清 堵塞针尖。 观察并记录电泳现象 剥胶：拆开电泳槽装置，用竹镊子轻轻撬开两层玻璃板，戴上一次性手套，用手和镊子将分离胶剥离到染色液盘内，染色15分钟。 脱色： 将分离胶小心完整地从染色液中移到脱色液内，脱色三次，每次10分钟（每次更换新鲜脱色液80-100ml），脱色时在摇床上摇。八、剥胶、染色、脱色点样线 2 1 清蛋白血清蛋白质醋酸纤维素薄膜 电泳示意图 +聚丙烯酰胺凝胶电泳血清蛋白 质区带分布示意图PAGE与醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质比较
