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1、重要农作物病原菌的抗药性及防治对策周 明 国南京农业大学植保学院2012.2.25 济南 单作用位点符合了农药的选择性要求 若：变异频率百万分之一2个位点100万2、3个位点100万3 多数病菌单倍体遗传、抗药性基因均显 性 病菌繁殖数量大、抗药性变异群体形成 快抗药性病害流行突发性、让人措手不及 形成抗药性病原群体才危害农业生产病菌抗药性的重要性 杀菌剂有何作用位点，变异频率？ 抗药性群体是如何形成的？ 抗药性病菌在群体中多少比例会引起流行 ？ 群体形成与哪些因素有关？ 哪些因素可以人为控制？ 如何识别/诊断？ 如何高通量检测，实现早期预警？ 如何治理？需要解决的科学与实践问题水稻恶苗病菌、
2、油菜菌核病菌和小麦赤霉病菌 多菌灵抗性为例 病原菌抗药性群体发展规律 抗药性机制 抗药性诊断与检测 抗药性治理对策难以检测的缓慢积累早期 引起防效下降的快速发展后期抗药性病原群体发展规律赤霉病菌多菌灵抗性群体发展态势（江苏） 变异频率：菌核 2.5X10-5、恶苗10-6、赤霉10-7 繁殖率： 病害严重度： 适合度 恶苗和菌核病菌高、赤霉病菌低 药剂选择压 3种病均用药1次，但效果不同影响抗药药性群体发发展的因子抗药性病害再猖獗时间：恶苗病3-5年菌核病5年赤霉病25-28年保护地灰霉、霜霉：1-3年恶苗病菌和菌核病菌-tub基因编码198 位氨基酸的密码子GAG（谷氨酸） GCG（丙氨酸）
3、抗药性变异频率较高（10-6）、 极高抗药水平 抗药性机制hptHSV-tk2-tub coding region First replacementhygB r hptHSV-tk2-tub coding region Second replacementF2dU r167、198、200位密码子TTTTAT、GAGAAG/CTG、TTCTAC 突变频率（10-7），中、高抗药性水平167位点突变占抗药性群体96.3%突变位点不同可能与突变频率及适合度低有关Chromosome 4 (8,466Mb)0cM230cM2- tubulin-tubulin赤霉病菌2-tub基因点突变产生抗药性离
4、体：29个抗药性菌株: 88.7 g DON/g dwm29个敏感菌株： 23.4 g DON/g dwm多菌灵抗性增加赤霉病菌DON毒素合成田间麦穗:菌株20072008DON/麦粒 (mg/kg)菌/麦粒 (g/ kg)DON/grain (mg/kg)菌/麦粒 (g/kg)抗药药菌171.8a22322a212.3a30024a敏感菌 9.11.3b17013b121.6b21819bTri5 的检测限为1 pg DNA 2-tub基因突变对DON合成的影响 突变型离体 DON g/g 20072008麦粒中 DON mg/kg麦粒中 菌量 g/kg麦粒中 DON mg/kg麦粒中 菌量
5、 g/kgZF21 /多菌灵敏感28b7.5b149b9.8b194b240位突变 /多菌灵敏感26b7.3b141b8.6b191b167位突变 /多菌灵中抗54a16a218a22a306aTri5基因表达与 DON产量MBCS MBCRProcedure of Tri5 expression in incubationRelation of Tri5 expression level and DON productionMolecular Plant-Microbe Interaction,99(1):95-100(2009)处理剂量 (g a.i.ha-1)20062007 DON/麦
6、粒 (mg kg-1)DON/麦粒 (mg kg-1)CK-9.31.1 a7.70.7 a福美双6006.30.8 b5.20.4 b多菌灵3759.11.2 a8.10.9 a戊唑醇1251.30.2 c1.20.1 c嘧菌酯2509.60.8 a7.80.6 a氰烯菌酯3751.10.2 c1.00.1 c戊 福4051.50.2 c1.50.2 cPhytopathology 99:95-100(2009)不同杀菌剂防治赤霉病对DON毒素污染的影响IsolateIntegron size (bp)Order of gene in cassetteResistance phenotype
7、YNA7-14041aac(6)- arr-3 - aadA1Tobramycin, Gentamicin, Netilmicin, Kanamycin, Streptomycin, Spectinomycin YNA10-23173arr-3-aadA1Rifampin, Streptmycin, Spectinomycin YNA12-23251aac(6)- arr-3 - aadA1Tobramycin, Gentamicin, Netilmicin, Kanamycin, Streptomycin, Spectinomycin 链霉素抗性存在超级细菌的风险Gene cassette抗
8、药性快速诊断技术Tetra-primer ARMS-PCR：基于2-微管蛋白 基因在氨基酸167、198和200位抗药性变异 的单核苷酸多态性及Tetra-primer ARMS- PCR的原理，通过在每个位点分别设计两对 引物进行PCR扩增PIRA-PCR：利用内引物人为引 入2-微管蛋白基因167位的 Hind酶切位点，和200位抗药 性突变自然形成的酶切位点TaaI （Tsp4CI）对PCR产物酶切。限制性酶切：基于-微管蛋白基因197和198位密 码子抗药性变异（GACGAGGACGCG）形 成ThaI酶切位点（3CGCG 5），可以将 B1/B3引物的扩增产物酶切成193bp和681
9、bp 片段，而敏感菌株（MBCS）的PCR产物则不 被酶切。 ASO-PCR：以-微管蛋白基因198位突变密码子 作为3末端碱基，设计两对等位基因特异性引 物，用于“nested”PCR或直接从菌丝基因组 DNA扩增。根据酶切产物或PCR产物电泳图谱 诊断菌核病菌对多菌灵的抗药性。 SYBR GREEN荧光实时定量PCR高通 量检测技术。基于菌核病菌-微管蛋白基 因198位突变密码子和该基因内含子保守 序列，分别设计2对特异性引物（ RFP4/RRP和SclSF/SclAF）扩增DNA片 段，采用SYBR GREEN荧光染料提高检 测灵敏度。可检测出菌核病菌0.0028ng DNA模板含 量，
10、准确率达99.5%。 Cycling Probe荧光探针实时定量PCR高通量 检测技术。基于赤霉病菌2-微管蛋白基因167 位氨基酸密码子突变，通过增加人为错配突破 了假阳性的技术瓶颈，设计出一对特异性引物 （Codon167F/Codon167R），并分别标记不 同荧光报告基团的Cycling探针，可检测167位 是否点突变。实现早期预警，防范抗药性病害突发流行治理对策-阻止、延缓抗药性群体流行危害影响群体形成因子：变异频率、繁殖率、适合度、病害严重 度药剂选择压-单位点、高效、连续使用抗药性监测 减轻病害严重度-降低病害压力 抗病品种选育与利用扬麦、苏麦品系 栽培措施轮作、合理肥水管理、深
11、埋 病残体等 农事操作技术-田园卫生、减少损伤防止相同类型杀菌剂的连续使用不同类型药剂的轮用交替使用不同类型药剂的混用桶混或复配剂 开发新类型的杀菌剂没有交互抗药性没有化学、生物学、环境毒理学的同等投入 和平等合作，就不可能有我国农药的原始创新抗药性治理就必须依赖国外的新农药1、二硫氰基甲烷首创的水稻种子处理剂，多作用位点 、干扰呼吸链Complex IV和膜透性防治恶苗病、干尖线虫病效果95%用量不足常规药剂1/25 安全系数3倍以上无需预浸和清洗，方法简便使用20年无抗性2、原始创新型杀菌剂氰烯菌酯 氰烯菌酯（JS399-19) 江苏省农药研究所股份有限公司 国家南方农药创制江苏基地 突破
12、了创制现有结构的同系物 思路，实现化学与生物学合作 制剂：25%SC登记号：原药LS20072660；25%悬浮剂：LS20072657 n群体中的敏感性差异小 EC50：0.150.05 g/mL； EC90：0.710.25 g/mL； 最低抑制浓度（MIC）4.0 g/mL。EC50活性是多菌灵的4倍，EC90活性=多菌 灵，但MIC活性是多菌灵的1/3。0102030405000.050.10.15 0.20 0.25 0.30 EC50 (ug/mL)Frequency (%)主要对镰刀菌表现特异性活性对其他生物安全氰烯菌酯对赤霉病菌分生孢子萌发的影响CK 50 ppm 100 pp
13、mCK0.1g/mL0.5g/mL2.5g/mLsR24h10h 叶片对药剂的吸收和输导方向 可被叶片吸收、并向上输导，分布均匀 氰烯菌酯的保护性测定 400 g/mL氰烯 菌酯在侵染前 三天和后三天 内用药 多菌灵对抗药 性病害无效氰烯菌酯和多菌灵预防处理的麦穗氰烯菌酯和多菌灵治疗处理的麦穗2010年江苏白马湖农场试验示范处处 理病穗率防效%病指防效%淮麦22 淮麦19华华麦1号平均防效 淮麦22 淮麦19华华麦1号平均防效25%氰烯氰烯 菌酯酯 SC mL10086.391.580.986.285.787.780.184.512587.993.476.786.088.886.881.085
14、.515092.294.978.888.688.489.482.186.640%多菌灵 SC 100mL86.588.268.481.086.586.876.383.2对对照病情41.840.997.023.522.763.7收获前5月30日调查，手动喷雾2次，50kg/亩2010年江苏农垦新洋农场农场示范试验27大队第6号地，明麦6号，0.65亩， 弥雾40公斤2次，5月31日调查处处 理病穗率 %病穗率 防效%病指 %病指防 效% 25% 氰烯氰烯 菌酯酯 SC100mL3.3389.00.9292.2 150mL1.3395.60.6794.3200mL2.093.40.7593.640
15、%多菌灵SC 100mL6.080.22.2580.7 CK30.33/11.67/2010年江苏农垦新洋农场农场示范试验27大队第7号地，明麦6号，0.78亩， 弥雾40公斤2次，5月31日调查处处 理病穗率 %病穗率 防效%病指 %病指防 效% 25% 氰烯氰烯 菌酯酯 SC100mL1.6793.50.4295.7 150mL0.6797.40.1798.3200mL0.6797.40.1798.340%多菌灵SC 100mL 3.3387.01.089.7 CK25.67/9.67/2010年江苏农垦东辛农场农场示范试验 烟农19，手动喷雾2次，15kg水/亩处处 理病穗率%防效%病指
16、 病指防效% 增产产%25%氰烯氰烯 菌酯酯SC100mL9.5036.7bB5.9843.5bB-125mL5.6862.2cBC4.0661.6bBC25.49150mL5.9760.2cBC3.8064.1bBC37.6340%多菌灵 SC 100mL1.8987.4dC1.2887.9cC11.68CK15.01aA10.57aA/江苏白马湖农场示范（2010年6月3日）病穗率96.2%病穗率4.1%处 理剂量(g a.i.ha-1)20062007穗发病率（%） 防 效 (%)穗发病率（%）防 效 (%)空白对照30.6 a/25.1 a/福美双60025.7 b16.221.2 b15.4 多菌灵37519.3 c37
