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1、第一章 蛋白质-理化性质和分离纯化【掌握】 蛋白质的酸碱性质；蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 ；蛋白质的盐溶和盐析。 【熟悉】 蛋白质分离纯化的一般原则；蛋白质分离纯化方法1. 根据分子大小不同的纯化方法2. 利用溶解度差别的纯化方法3. 根据电荷不同的纯化方法 【了解】 蛋白质相对分子量的测定；蛋白质的含量测定与纯度鉴 定。第一章 蛋白质-理化性质和分离纯化第六节、蛋白质的理化性质第六节、蛋白质的理化性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀二、蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀三、蛋白质分离纯化的一般原则三、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质的分离纯化方法四、蛋白质的分离纯化方法第七节、蛋白质的分离、
2、纯度与鉴定第七节、蛋白质的分离、纯度与鉴定一、蛋白质的两性电离及等电点一、蛋白质的两性电离及等电点蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团从而使蛋白质带电。蛋白质所带电荷的性质和数量是由可解离基团的种类和数目以及溶液的pH决定。 、蛋白质的两性电离和等电点 一、蛋白质的两性电离及等电点蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性碱/酸越大pI 越大lpI通常在 6.0 左右蛋白质两性解离性质和等电点pH = pI净电荷=0pH pI净电荷为负Pr COOHNH3+ H+ OH-+ H+ OH-Pr COO-NH2 Pr COO-
3、NH3+当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，总净电荷为零，成为两性离子，在电场中，蛋白质分子既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点 （pI） 每个蛋白质都有特定的等电点，与所含氨基酸的种 类和数量决定 所含碱性氨基酸多，PI偏碱；所含酸性氨基酸多， PI偏酸；两者相等， PI中性偏酸 蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在 电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电 场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳 在一个特定的值中，各种蛋白质等电点不同， 所带电荷性质和数量也不同，分子质量和颗粒大小 不同，因此它们在电场中移动
4、的方向和速度也不同 ，能彼此分开电泳方法：1、电泳和等电聚焦法：l普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳l从电泳结果分：自由界面电泳、区带电泳l从装置上分：圆盘电泳（柱状）、水平板电泳、垂直板电泳 。l从支持物分：自由界面电泳、纸电泳（或薄膜电泳）、凝胶 电泳（PAGE ，琼脂糖胶，淀粉胶等）电 泳 技 术 分 类垂直板电泳毛细管电泳水平板电泳电 泳 支 持 物滤纸凝胶薄膜圆盘电泳纸电泳分散体系 一种物质以极小的颗粒（分散相）分散在另一种物质（分散介质）中所组成的体系。分散相质点半径100nm:悬浊液分散系二、蛋白质的胶体性质与沉淀 1.胶体溶液保持稳定的条件：分散相质点大小分子直
5、径在1-100 nm范围内，这种大小 的质点在动力学上是稳定的。分子在介质中做不断的布 朗运动。 分散相质点带同种净电荷，相互排斥，不易聚集成大颗 粒而产生沉淀。 分散相质点能与溶剂形成溶剂化层，例如与水形成水化 层，相互间不易靠拢而聚集。(一)溶质质点胶体性质1、蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之间，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。2、蛋白质分子表面有亲水基团。3、一种蛋白质在适当的pH条件下都带有相同电荷。* 蛋白质胶体稳定的因素l由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够 形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的 典型性质，如丁达尔现象、布郎运动、不能 通过半透膜
6、等。 l由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜 ，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂 质除去。+ +带正电荷的蛋白质 带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜+带正电荷的蛋白质 带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉(二). 蛋白质的沉淀作用蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化 作用有关。 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。1.可逆沉淀可逆沉淀(1)在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质 从胶体溶液中沉淀分离。 (2) 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适
7、当的条 件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉 淀。 (3)可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀 法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。2.2.不可逆沉淀不可逆沉淀(1)在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳 定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质 沉淀不可能再重新溶解于水。(2)由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所 以又称为变性沉淀。(3)如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉 淀等都属于不可逆沉淀。选择性沉淀蛋白质的方法盐析法:在蛋白质溶液中加入大量的中性盐（NH4）2SO4 、Na2SO4、Nacl，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋
8、白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。作用机制:中和电荷的同时破坏水化膜盐析时，pH在蛋白质的等电点处效果最好。优点: 盐析沉淀蛋白质通常不会引起蛋白质的变性。& 分段盐析：半饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较大的血浆球蛋白,而饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较小的血浆清蛋白。因此,使用不同浓度的硫酸铵溶液就可将分子量不同的蛋白质进行初步分离。有机溶剂沉淀法： 破坏水化膜，降低介电常数，增加带电 质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒凝聚沉淀。PEG、丙酮、乙醇等重金属盐沉淀：pHpI时带负电荷，与重金属离子（ Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）结成不溶性沉淀生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于等电时，蛋白质带正
9、电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀 。生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、钨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。加热变性沉淀。等电点沉淀法。(三)、蛋白质变性与复性 蛋白质各自所特有的高级结构，是表现其物理性质和化学特性以及生物学功能的基础。当天然蛋白质受到某些物理因素和化学因素的影响，使其分子内部原有的高级构象发生变化时，蛋白质的理化性质和生物学功能都随之改变或丧失，但并未导致其一级结构的变化，这种现象称为变性作用（denaturation）。表征：生物活性丧失；物理性质（溶解度、粘度、扩散系数、光谱特性等）和化学性质（化学反应，被酶解性）改变应用：变性灭菌、消毒；变性制食品；抗衰老蛋白质
10、的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象成为复性（renaturation）。或者引起生物功能丢失的三维结构改变称为变性。或者引起生物功能丢失的三维结构改变称为变性。变性状态不一定是蛋白质的完全伸展和构象完全无序化。变性状态不一定是蛋白质的完全伸展和构象完全无序化。 有的变性蛋白质还以局部折叠形式存在。有的变性蛋白质还以局部折叠形式存在。 核糖核酸酶变性与复性作用Native ribonucleaseDenative reduced ribonucleaseNative ribonucl
11、ease8 M urea and -mercapotoethanolDialysis变性复性 造成变性的因素 如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等化学因子；加热、紫外线、射线等物理因子 。 变性的本质 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。应用:利用变性: 酒精消毒、高压灭菌、血滤液制备防止变性：低温保存生物制品取代变性：乳品解毒（重金属中毒解救）六、蛋白质的颜色反应1. 双缩脲反应2. 米伦氏反应酪氨酸的特有反应3. 乙醛酸反应色氨酸的特有反应4. 坂口反应精氨酸特有的反应5. 福林酚试剂反应6. 茚三酮反应7. 黄色反应-芳香族氨基酸的特有反应8. 考马斯亮
12、蓝G2501.双缩脲反应：两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成红紫色的复合物 含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样的反应 肽键的反应，肽键越多颜色越深 粉红，紫红，蓝紫 受蛋白质特异性影响小 蛋白质定量测定；反应物在A540nm处有最大光吸收，测定蛋白质水解 程度2. Folin-酚（福林）试剂反应所用试剂由A、B两部分组成，试剂A相当于双缩脲 试剂，试剂B为磷钼酸和磷钨酸。酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应） 福林试剂：磷钼酸-磷钨酸 与双缩脲法结合-Lowry法 在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应，蛋 白质-铜紫红色络合物。 将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物 灵敏度提高100倍
13、反应非常灵敏，测定微量蛋白质的常用方法6.茚三酮反应 灵敏度差分离纯化的意义从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与 功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本 质有重大意义； 工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业， 需要大量的高活性的酶制剂；（如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等 ） 医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病； 基因工程的需要。蛋白质分离纯化的一般原则总目标：增加制品纯度或比活第七节 蛋白质的分离、纯化与鉴定分离纯化的要求1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为 研究其一级结构和空间结构的蛋白、一级结构与功能的 关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋
14、白、酶法分析的酶 制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质 制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。 2、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活 性。 3、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不 少损失，而且提纯步骤越多，损失越大。制备的一般过程和原则确立有效成分的测定方法 材料的选择和预处理 细胞的破碎和细胞组分分离 有效成分的抽提 有效成分的纯化和浓缩生物大分子的制备有以下主要特点：生物材料的组成极其复杂，含有数百种乃至几千种化合 物。生物大分子含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失 活，因此分离过程中如何防止其失活，
15、就是生物大分子提 取制备最困难之处。生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH 值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响， 很难准确估计和判断。 生物大分子分离纯化的一般步骤和原则层析法 电泳法 超离心法 透析和超滤盐析（硫酸铵盐析） 等电点沉淀 有机溶剂沉淀 离心前处理 粗分级 细分级 材料选择与处理 细胞破碎（机械破 碎、溶账和自溶、 酶解、化学处理）生物组织 提取液 粗产品结晶分子大小 溶解度 电荷性质 吸附性质 生物亲和力依据原理注意事项基本原则：防止生物分子变性、降解 1控制适当的pH 2控制低温 3注意提取过程中的溶液环境 4防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚 基分
16、离纯化的前处理(1)、材料的选择与预处理 选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意 选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、 成本低的动植物组织或微生物做原料。科研选材则 无需考虑上述问题，只要能达到实验目的即可。 实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材 料需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织 ；植物种子需要除壳；微生物需要将菌体与发酵液 分开。另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加 工处理，若不立即进行实验或加工，应冷冻保存。（2）、细胞的破碎 分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子 从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来， 并保持原来的天然状态，不丢失其生物活性。因 此
